Name: use of an influenza antigen microarray to measure the breadth of serum antibodies across virus subtypes
Uploaded: 2019-07-26T14:45:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes at JoVE.com

Författarna skulle vilja erkänna prof. Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) för att samla in Human sera under University of Maryland IRB protokoll #313842 finansieras av DARPA N66001-18-2-4015 P00001. Författarna skulle också vilja erkänna prof. Florian Krammer (Icahn School of Medicine, MT. Sinai, NY, USA) för att tillhandahålla trimerized HA och NA antigener finansieras av ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan stöds delvis av National Center for Research Resources och National Center for framryckande translationella vetenskaper, National Institutes of Health, genom Grant KL2 TR001416. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på NIH.

Alla humana sera hanteras och bortskaffas enligt godkända institutionella protokoll för biosäkerhet med användning av skyddande personlig utrustning. All laboratoriepersonal som deltar i detta protokoll har fått utbildning i biosäkerhets-och forskningsetik.
1. producera influensa antigen mikromatriser
<ol><li>
Designa och få antigen set för microarray
	<ol>
<li>Erhålla uttryckta och renade proteinantigener som frystorkat pulver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Skriva ut antigener på mikroarraybilder
	<ol>
<li>Bered varje frystorkat antigen till en koncentration av 0,1 mg/mL i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,001% Tween-20 (T-PBS). Överför 10 μL av varje rekonstituerat antigen till enskilda brunnar i en obehandlad 384-väl platt bottenplatta.</li>
		<li>Skriva ut antigener med en microarray-skrivare (den microarray skrivare som används i denna studie är inte längre kommersiellt tillgänglig, se diskussion) med låg volym mikroarray spotting stift som aspirera antigen i provet kanalen och insättning via direkt kontakt och kapillärverkan på 16-pad nitrocellulosa-belagda glas rutschbanor.<ol>
<li>Programmera utskriftsprogrammet (t. ex. gridder) med käll plattans konfiguration och utskriftsparametrar.<ol>
<li>Använd rullgardinsmenyn för att välja namnet på den platttyp som ska användas med den här utskriftsmetoden. För denna studie, Använd en obehandlad 384-väl platt bottenplattan.</li>
				<li>Markera textrutan bredvid antal plåtar och ange antalet Provplåtar som ska användas i det här utskriftsprotokollet. För denna studie, Använd 1 tallrik.</li>
				<li>Välj en PIN-konfiguration som ska användas med den här metoden. För denna studie, Använd en 8-stifts konfiguration.</li>
				<li>Se till att ursprungs förskjutningar är avstånden (i X-och Y-riktningarna) mellan bildens ursprung (som är kalibrerad i det administrativa avsnittet) och den plats där utskrifts stiften ska börja skriva ut på bilderna.</li>
				<li>Använd fliken array design och definiera matrisens storlek och form (punktavstånd och antal punkter per subarray). För denna studie, Skriv ut 324 fläckar (180 μm diameter med 300 μm mellanrum) på 16-pad diabilder i en 18x18 format med 8 stift.</li>
				<li>Välj parametrarna för hur tryck stiften plockar upp och dispensera prover. För denna studie, varje PIN aspirrates 250 nL av antigen lösning och skriver 1 nL på varje 40 fläckar (totalt 20 bilder för alla 8 stift)</li>
				<li>Konfigurera PIN-rengöringprotokollet och blotting-protokollet. För denna studie, varje stift skriver ut antigen, doppas i steril ddH2O i sonicated tvätta behållaren, och sedan aspirerade nästa antigen.</li>
				<li>Definiera sekvensen där exempel blocken skrivs ut på bilderna. Array programvaran kommer att konstruera en kommenterade Grid index (. gal) fil för att beskriva arrangemanget av antigener inom varje microarray. Obs: den översta raden används för fiducials (med fluorescens vid alla våglängder som används vid avbildning, t. ex., blandning av qdot 585 nm konjugerat konjugat och qdot 800 nm konjugerat konjugat i denna studie) för att orientera galler under avbildning. Vid långa tryck körningar kan antigener i käll plattan periodiskt återsuspenderas genom pipettering upp och ner och sedan centrifugering, eller så kan ny käll platta förberedas och användas.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Placera un-probed microarray diabilder i en ljustäta låda och förvara i en exsickator skåp vid rumstemperatur för långtidslagring. Obs: protokollet kan pausas på obestämd tid på denna punkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utföra kvalitetskontroll kontrollera (kräver Poly-Histidine taggar)
	<ol>
<li>Fäst bilden i sondering-kamrarna och rehydrera med blockeringsbuffert enligt beskrivningen i steg 2.1.1-2.1.2 och visas i figur 2.</li>
		<li>Späd musen monoklonal Poly-his antikropp 1:100 i filtrerad 1x blockerande buffert. Anmärkning: om icke-renat protein antigen (t. ex. uttryckt i in vitro-transkription och översättningssystem) används direkt för att skriva ut mikromatriser, Lägg till komponenter i protein uttrycks systemet (t. ex. e. coli lysat) i förhållandet 1:10 med blockeringsbuffert som används för serumutspädning för att blockera alla antikroppar riktade mot dessa komponenter.</li>
		<li>Tillsätt 100 μL utspädd Poly-his antikropp till varje bild kammare som innehåller mat ris dyna efter aspiration och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° c i shaker. Tvätta 3x med T-TBS buffert enligt beskrivningen i steg 2.2.1. Späd biotin-konjugerat get-antimus-IgG sekundär antikropp 1:200 i blockerande buffert, tillsätt 100 μL per brunn efter aspiration, och inkubera i 1 h vid rumstemperatur på shaker. Tvätta 3x med T-TBS buffert.</li>
		<li>Späd qdot 585 nm konjugerat konjugat till 4 nm i blockerande buffert, tillsätt 100 μl per brunn efter aspiration, och inkubera i 1 h vid rumstemperatur på shaker. Tvätta 3x med T-TBS-buffert och sedan en gång med TBS-buffert (utan interpolering).</li>
		<li>Dissemble och kvantifiera diabilder enligt beskrivningen i steg 2.2.5 – 3.1.2. Anmärkning: protein antigener måste innehålla sina10 taggar för att använda denna kvalitetskontroll protokoll. Alternativt, om en annan tagg ingår, kvalitetskontroll kontrollera kan utföras med antikropp eller ligand för den taggen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sond serum för influensa antikroppar med mikromatriser
<ol><li>
Inkubera serum på mikromatriser för antikroppsbindning
	<ol>
<li>Fäst mikroarraybilder i kamrarna med hjälp av clips och placera dem i bildrutor enligt figur 3. Obs: Undvik alltid att vidröra microarray pad med händer och instrument. Se till att bilderna är orienterade med pad Sidan upp och den lilla skåran i övre högra hörnet.</li>
		<li>Rehydrate microarray diabilder med 100 μL per brunn av filtrerad 1x blockerande buffert, och späd serum 1:100 i 100 μL av blockerande buffert (kan använda obehandlad 96-bra plattor eller 2 mL rör). Inkubera både rehydrerade mikroarraybilder i täckta ramar och utspädda serum separat under 30 minuter i rumstemperatur på orbitalskakan vid 100-250 RPM. Utför alla efterföljande inkubations steg på samma sätt på skakapparaten. Anm.: serum skall vara aliciterat och fryst vid-80 ° c för långtidsförvaring för att minimera frysnings cykler och bör vortexeras för att blanda och centrifugeras för att avlägsna partiklar före användning. Observera glid kammare noggrant under och efter detta steg för att upptäcka eventuella läckage som kräver återmontering av Skjut kammare.</li>
		<li>Använd pipettspetsar som är anslutna till en vakuum linje med sekundär uppsamlings kolv och aspirera försiktigt blockerande buffert från hörn av varje kammare utan att röra vid dynorna. Utför alla efterföljande aspiration steg på samma sätt. Tillsätt utspädda sera till Pads snabbt efter aspiration för att inte tillåta kuddar att torka.</li>
		<li>Placera täckta ramar i brickor inuti en sekundär behållare omgiven av fuktiga pappershanddukar och förseglade för att förhindra avdunstning. Inkubera över natten vid 4 ° c på gungshaker (Alternativt kan Inkubera i 2 h vid rumstemperatur på orbitalskakan vid 100-250 rpm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etikettbundna serumantikroppar med Quantum-dot-konjugerade sekundära antikroppar
	<ol>
<li>Aspirera serum från kamrarna noggrant enligt beskrivningen ovan, tillsätt 100 μL per brunn av T-TBS-buffert (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 i ddH2O justerat till pH 7,5 och filtrerat, kan erhållas kommersiellt) och inkubera i 5 minuter på orbitalshaker vid 100-250 RPM. Upprepa detta tvättsteg totalt 3x (alla efterföljande tvättsteg utförs på samma sätt).</li>
		<li>Bered blandningen av sekundära antikroppar spädda till 1 μM i blockeringsbuffert och blanda grundligt genom pipettering före och under användning för att bibehålla homogenitet. Anmärkning: för att bibehålla analysen reproducerbarhet, bör samma parti av varje sekundär antikropp användas för alla sondera experiment där kvantitativ jämförelse av data mellan experiment planeras. Den specifika koncentrationen av sekundär antikropp kan behöva varieras beroende på affiniteten. Följ tillverkarens protokoll när det är tillgängligt.</li>
		<li>Aspirera buffert från kamrarna efter slutlig tvätt, tillsätt 100 μL per brunn av sekundär antikropps blandning, och inkubera i 2 h vid rumstemperatur på shaker.</li>
		<li>Aspirera sekundär antikropp blandningen tvätta 3x med T-TBS buffert, och sedan tvätta en gång med TBS buffert (utan interpolering).</li>
		<li>Dissemble microarray diabilder från kamrarna försiktigt för att undvika att röra kuddar, skölj försiktigt med filtrerad ddH2O, och torka genom att placera i 50 ml rör och centrifugering på 500 x g för 10 min.</li>
		<li>Placera sonderade microarray diabilder i en ljustäta låda och förvara i en exsickator skåp vid rumstemperatur för långtidslagring. Obs: protokollet kan vara pausat i upp till 1 vecka på denna punkt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kvantifiera antikroppsbindning till antigener inom microarray
<ol><li>
Visualisera microarray-bilder och kvantifiera spotfluorescensintensitet för att mäta antikroppsbindning
	<ol>
<li>Hämta bilder av microarray diabilder med hjälp av bärbara Imager med inbyggd programvara.<ol>
<li>På fliken Konfigurera Imager väljer du rätt bild konfiguration. För denna studie, Använd 16-pad diabilder.</li>
			<li>På fliken bildkontroll väljer du rätt Lysrörs kanal och justerar känsligheten, exponeringstiden och förvärvs tiden beroende på Reaktiviteten hos sera för att få optimala bilder. För denna studie, de fluorescerande kanalerna för IgA och IgG var 585 nm respektive 800 nm, och bildinställningar var vinst på 50, exponeringstid på 500 ms, och förvärvs tid på 1 s.</li>
			<li>Klicka på Capture för att starta processen att förvärva bilden. Obs: microarray diabilder kan åter avbildas på flera inställningar utan försämring av signalen så länge de lagras mörkt och torrt. Andra avbildningssystem kan användas om de är kompatibla med bilderna.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identifiera array spots med hjälp av rutnät orienterade baserat på de relaterat markörer och mäta spotintensitet som median av pixel intensitet minus bakgrund mätt runt fläckar. Utför den här kvantifieringsalgoritmen i batch med den inbyggda Imager-programvaran, som använder den. gal-fil som byggts i steg 1.2.2 för att ansluta spotintensiteter till enskilda antigener på varje mikromatris.<ol>
<li>På panelen filinformation laddar du upp. gal-filen genom att välja från dess mapp på datorn och anger den mapp där analysutdatafiler ska sparas i avsnittet analysalternativ .</li>
			<li>På fliken bildkontroll öppnar du en av de förvärvade bilderna som ska kvantifieras och väljer knappen Auto i det övre högra hörnet.</li>
			<li>I den array analys avsnitt i det nedre högra hörnet, skapa en relaterat mall enligt instruktioner från programvaran.</li>
			<li>Klicka på batchanalysen, Välj den mapp som innehåller de avbildningar som ska kvantifieras och välj den relaterat mall som skapades i föregående steg. Programvaran analyserar varje bild och kvantifierar spotintensiteten. Anmärkning: detta steg kommer att generera en. csv-fil som innehåller spotintensitet kvantifiera antikroppar inom varje serumprov som binder till varje enskilt antigen på mikromatrisen som sedan kan manipuleras i kalkylblads manipulation eller analysprogramvara.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analysera rådata för att jämföra antikroppsbindning mellan antigener och över serumprov. För denna studie jämfördes IgA-och IgG-antikroppar som mättes som 585 nm och 800 nm fluorescerande spotintensitet mellan alla antigener mellan 2 oberoende körningar av experimentet med hjälp av olika bilder på olika dagar, och korrelationsanalys utfördes för att Mät analys reproducerbarhet. Anmärkning: för icke-renade proteiner tryckta som uttrycks blandning, bör dataanalys inledas med bakgrund subtraktion av en ingen DNA-kontroll.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).</li><li>Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+influenza+viral+infection+through+the+murine+respiratory+tract:+the+protective+role+of+sleep+deprivation.">Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation.</a> Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+Estimates+of+the+Impact+of+Influenza+on+Population+Mortality:+A+Systematic+Review.">Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review.</a> American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).</li><li>Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+and+pandemic+influenza+preparedness:+science+and+countermeasures.">Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures.</a> Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).</li><li>Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Variability+in+Reported+Mortality+for+Critical+Illness+during+the+2009-10+Influenza+A(H1N1)+Pandemic:+A+Systematic+Review+and+Meta-Regression+to+Guide+Reporting+of+Outcomes+during+Disease+Outbreaks.">Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks.</a> PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).</li><li>Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+preventing+influenza+in+healthy+adults.">Vaccines for preventing influenza in healthy adults.</a> Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).</li><li>Erbelding, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+Influenza+Vaccine:+The+Strategic+Plan+for+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases.">A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3N2+Mismatch+of+2014-15+Northern+Hemisphere+Influenza+Vaccines+and+Head-to-head+Comparison+between+Human+and+Ferret+Antisera+derived+Antigenic+Maps.">H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps.</a> Scientific Reports. 5, 15279 (2015).</li><li>Tricco, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+influenza+vaccine+efficacy+against+mismatched+and+matched+strains:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC Medicine. 11, 153 (2013).</li><li>Katz, J. M., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+inactivated+influenza+A+virus+(H3N2)+vaccines+grown+in+mammalian+cells+or+embryonated+eggs.">Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs.</a> Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).</li><li>Zost, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+H3N2+influenza+viruses+have+a+glycosylation+site+that+alters+binding+of+antibodies+elicited+by+egg-adapted+vaccine+strains.">Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).</li><li>Davies, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays:+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery.">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).</li><li>Liang, L., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+for+diagnostic+and+vaccine+antigen+discovery+in+tropical+infectious+diseases.">A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantum+dot+immunofluorescence+and+a+digital+CMOS+imaging+system+as+an+alternative+to+conventional+organic+fluorescence+dyes+and+laser+scanning+for+quantifying+protein+microarrays.">Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays.</a> Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).</li><li>Desbien, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high+density+hemagglutinin+protein+microarray+to+determine+the+breadth+of+influenza+antibody+responses.">Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses.</a> Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).</li><li>Mace, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+arrayed+sensing+of+immune+response+to+influenza+antigens.">Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens.</a> Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).</li><li>Koopmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+humoral+immune+responses+to+influenza+viruses+by+using+protein+microarray.">Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray.</a> Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).</li><li>Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplex+Label-Free+Approach+to+Avian+Influenza+Surveillance+and+Serology.">A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology.</a> PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).</li><li>Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+influenza+virus+protein+microarray+to+measure+the+humoral+response+to+influenza+virus+infection+in+mallards.">Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards.</a> Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).</li><li>Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+humoral+immune+response+to+infectious+agents+using+high-density+protein+microarrays.">Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays.</a> Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).</li><li>Nakajima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Microarray+Analysis+of+the+Specificity+and+Cross-Reactivity+of+Influenza+Virus+Hemagglutinin-Specific+Antibodies.">Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies.</a> mSphere. 3 (6), (2018).</li><li>Van Hoeven, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Formulated+TLR7/8+Agonist+is+a+Flexible,+Highly+Potent+and+Effective+Adjuvant+for+Pandemic+Influenza+Vaccines.">A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines.</a> Scientific Reports. 7, 46426 (2017).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates.">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).</li></ol>

Författarna har inga avslöjanden.

Den influensa antigen microarray protokoll som beskrivs här är anpassningsbar till alla projekt som kräver att analysera antikroppssvar på många antigener. Den microarray plattform kan användas med någon önskad uppsättning av protein antigener uttryckt i alla system som kan uppnå 0,1 mg/mL eller högre avkastning med eller utan rening som tidigare beskrivits12. Om icke-renat protein antigen (t. ex. uttryckt i in vitro-transkription och översättningssystem) används direkt för att skriva ut mikromatriser, bör komponenterna i protein uttrycks systemet (t. ex. e. coli lysate) tillsättas 1:10 till blockeringsbuffert som används för spädning av serum och antikroppar för kvalitetskontroll för att blockera alla antikroppar riktade mot dessa komponenter. Bildkonfigurationer är tillgängliga med ett lägre antal större kuddar på varje bild för att rymma ett högre antal antigener per matris. För denna studie använde vi en GeneMachines OmniGrid 100 microarray skrivare som utnyttjar stift som direkt kontakt med nitrocellulosa yta att deponera fläckar på matrisen. Även om denna microarray-skrivare inte längre är kommersiellt tillgänglig, kan andra kommersiellt tillgängliga microarray-skrivare användas i detta protokoll men kan kräva anpassade Pins (antingen kontakt eller icke-kontakt) och programvara och bör ha tillräcklig plats upplösning och kompatibilitet med bilder och Imager. Beroende på reaktivitet av serum kan spädningar från 1:50 till 1:400 användas. Serum fri buffert kan användas som en negativ kontroll, medan monoklonala antikroppar som är kända för att binda till antigen kan användas som en positiv kontroll.
Användarna bör vara medvetna om några felsökningsproblem. Syftet med kvalitetskontroll kontrollen med hjälp av antikroppar mot hans tagg är att kontrollera om det finns några antigener för vilka utskriften inte lyckades. Alla fläckar som konsekvent ger låg signal i kvalitetskontroll kontrollera av flera matriser sannolikt representerar otillräcklig antigen tryckt. Möjliga orsaker är aggregering eller nederbörd eller antigen i käll plattan eller dålig kontakt mellan tryckning stift och microarray glida på grund av varierande tjocklek av nitrocellulosa pad. Vid denna punkt, vi utför inte analys normalisering baserat på kvantitativa resultat av kvalitetskontroll kontrollen, med tanke på att den upptäckta bindningen av anti-his antikroppar kan påverkas av tillgängligheten av denna tagg, som beror på den 3-dimensionella konformation specifika för varje antigen.
Mikromatrisen för influensa antigen ger flera fördelar jämfört med traditionella metoder som ELISA och kompletterar funktionella analyser som HAI och MN. Den 16-pad proteinet microarray är en prov-sparing teknik med kapacitet att mäta antikroppar av flera isotyper samtidigt mot cirka 300 antigener från 1 μL serum. Antalet antigener kan ökas till tusentals genom att minska antalet kuddar per diabilder. Multiplexade assay också reservdelar personal tid och förbrukningsmaterial resurser, med tanke på att hundratals serum kan sonderade för antikroppar i 2 dagar, och alla andra material än diabilder och reagenser är återanvändbara så inte genererar stora mängder plastavfall.
Även om microarray-skrivare inte kan distribueras i stor utsträckning, kan microarray-bilder skrivas ut på en central plats och sedan transporteras till slutanvändaren för att sondera. Den enda utrustning som krävs för avsökning är låg kostnad och bärbar Imager. Målet med att sprida detta protokoll är att göra utnyttjandet av denna teknik mer utbredd.
De viktigaste begränsningarna för influensa antigen microarray är oförmågan att karakterisera funktionen och kinetiken hos de upptäckta antikropparna. Microarrayen detekterar en polyklonala uppsättning bindande antikroppar för varje antigen. Dessa antikroppar kan eller inte kan vara funktionella i neutraliserande virus i HAI och MN analyser. Men, HAI och MN analyser kräver levande virus kultur med tillhörande behov av specialiserade anläggningar med hög nivå biosäkerhet skåp för att testa för antikroppar mot aviär subtyper av influensa, medan proteinet microarray inte innebär levande virus komponenter så kan utnyttjas i alla grundläggande laboratorium. När det gäller bindningskinetik ger en enda utspädning av serumprobed med en matris som innehåller en enda koncentration av varje antigen en enda datapunkt, som representerar en sammansatt mängd och tillhörighet som summerats över alla antikroppar som binder till antigenet . För att fullt ut lösa antigener-antikroppsbindningskinetik krävs multipla antigen koncentrationer och/eller seriella utspädningar av serum.
Trots dessa begränsningar, är influensa antigen microarray ett användbart verktyg för att karakterisera bredden av influensa antikroppar över det antigena landskapet som kan komplettera funktionella analyser som är mer begränsade i dataflöde och tillgänglighet.

Influensaviruset är ansvarigt för en förlust av 20 000 000 levnadsår årligen genom dödsfall eller funktionshinder, inklusive 1% av alla dödsfall i världen varje år, med oproportionerliga konsekvenser för äldre och populationer i tropikerna och utvecklingsländerna1, 2,3. Förutom sjukdomsbördan för säsongsbetingade epidemier kan uppkomsten av nya influensa stammar via genetiska re-sortiment, antingen naturligt i gemensamma värdar eller artificiellt för bioterrorism, leda till globala pandemier med snabb spridning och hög dödlighet 4 , 5. även om många influensavacciner för närvarande finns tillgängliga begränsas deras effektivitet av subtypspecificitet6, vilket skapar behovet av att utveckla universella influensavacciner som ger långvarig immunitet mot multipla virus stammar7.
En viktig utmaning för utvecklingen av universella influensavacciner är en hög antigenisk mångfald mellan stammar. Den antigena specificiteten hos nuvarande vacciner kombinerat med antigena variationer av cirkulerande virus skapar en obalans mellan vaccinstammar och cirkulerande stammar. Detta ger en evolutionär fördel som gynnar ytterligare genetisk drift bort från vaccinstammar under en epidemi, begränsa Vaccineffekten ofta till mindre än 50%8,9. En ytterligare källa till antigen obalans är äggadaptiva virala mutationer som genereras under vaccin tillverkningen, vilket leder till antikroppar som binder dåligt till cirkulerande virus10,11.
Att övervinna denna utmaning av hög antigen mångfald kommer att kräva nya forskningsverktyg för att karakterisera bredden av redan existerande och framkallade immunsvar över kliniskt relevanta antigena varianter i serum och slemhinnor prover. För närvarande tillgängliga metoder, inklusive hemagglutinering hämning (Hai), mikroneutraliseringstest (MN), och traditionella Elisa, är begränsade till att upptäcka antikroppar mot en enda virusstam i taget, så deras användning för detektion av flera antikroppar isotyper mot flera virusstammar snabbt uttömmer tillgängliga kliniska prov och laboratorieresurser. Dessutom kräver HAI och MN levande virus kultur som endast finns i specialiserade laboratorier.
Proteinmikromatriser, potentiellt bestående av upp till tusentals antigener tryckta på nitrocellulosabaserade diabilder som visas i figur 1, kan fylla detta behov12. Dessa mikromatriser kan produceras och sonderade i en hög genomströmning sätt medan konsumerar små mängder av kliniskt prov för att bestämma kvantitativa antikropp isotyp/subtyp nivåer mot varje enskilt antigen på matrisen. Denna metod för antigen upptäckt har tillämpats på diagnostik och vaccinutveckling mot flera infektiösa patogener13. Hittills har vi producerat proteinmikromatriser för över 35 patogener inklusive över 60 000 totalt uttryckt proteiner och använde dem för att söka över 30 000 mänskliga serum från infekterade och kontrollera individer. En nyligen utvecklad bärbar avbildning plattform för microarray diabilder har gjort denna metod mer tillgänglig för slutanvändaren14.
Bygger på omfattande tidigare arbete av flera bidragsgivare i fält15,16,17,18,19, en influensa protein microarray utvecklades nyligen som innehåller över 250 renade hemagglutinin (ha) antigena varianter med representation av alla 18 subtyper12,20. Med denna metod visades en naturlig influensainfektion för att generera allmänt reaktiva IgG-och IgA-antikroppar mot fylogenetiskt relaterade HA-subtyper, medan en intramuskulär influensavaccination endast genererade subtypspecifika IgG antikroppar21. Emellertid, lägga till ett adjuvans som aktiverar Toll-liknande receptorer till influensa vaccin visades att bredda den framkallade IgG antikropp svar över HA subtyper i djurstudier22.
Denna microarray används för närvarande för att avsöka serum som samlats in från en prospektiv kohortstudie av högskolestudenter som följdes för influensainfektion. Här rapporteras metoden för mikromatrisen för influensa antigen med demonstration av analys reproducerbarhet för att påvisa subtypspecifika och tvär reaktiva antikroppar i en delmängd av prover från denna studie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-pad nitrocellulose-coated glass slides</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>305016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x GVS FAST blocking buffer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10485356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayCam portable imager</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>400S</td>
			<td>Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>31800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBase 384-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>T-3037-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray pins</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>GMP2</td>
			<td>Each different microarray printer may require its own custom microarray pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal poly-His antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniGrid 100 microarray printer</td>
			<td>GeneMachines</td>
			<td></td>
			<td>The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide chambers</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>246890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide clips</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>204838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide frames</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>246879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>110620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Q10111MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of an influenza antigen microarray to measure the breadth of serum antibodies across virus subtypes

Influensaviruset är fortfarande en betydande orsak till dödlighet i hela världen på grund av den begränsade effekten av tillgängliga vacciner. En viktig utmaning för utvecklingen av universella influensavacciner är hög antigenisk mångfald till följd av antigen drift. Att övervinna denna utmaning kräver nya forskningsverktyg för att mäta bredden av serumantikroppar riktade mot många virusstammar över olika antigena subtyper. Här presenterar vi ett protokoll för att analysera bredden av serumantikroppar mot olika influensavirusstammar med hjälp av ett protein microarray av influensa antigener.
Detta influensa antigen microarray är konstruerad genom att skriva ut renade hemagglutinin och neuraminidastyp antigener på en nitrocellulosa-belagda membran med hjälp av en microarray skrivare. Humana serum inkuberas på mikromatrisen för att binda antikroppar mot influensa antigener. Quantum-dot-konjugerade sekundära antikroppar används för att samtidigt detektera IgG-och IgA-antikroppar som binder till varje antigen på mikromatrisen. Kvantitativ antikroppsbindning mäts som fluorescensintensitet med hjälp av en bärbar Imager. Representativa resultat visas för att påvisa reproducerbarhet i analysen vid mätning av subtypspecifika och Cross-reaktiva influensa antikroppar i humanserum.
Jämfört med traditionella metoder som Elisa, ger influensa antigen microarray en hög genomströmning multiplexade metod som kan testa hundratals serum för flera antikroppar isotyper mot hundratals antigener i en kort tidsram, och därmed har tillämpningar inom seroövervakning och vaccinutveckling. En begränsning är oförmågan att särskilja bindande antikroppar mot neutraliserande antikroppar.

Som en demonstration av protokollet, analyserades baslinje serum från 16 individer inom en prospektiv kohortstudie av högskolestudenter som följdes för influensainfektion på mikromatrisen för influensa antigen. För att demonstrera analys reproducerbarhet, dessa prover var sonderade två gånger, på olika diabilder och olika dagar.
För denna studie, renade influensa antigener som innehåller hans10 Taggar erhölls från kommersiell säljaren (se tabell över material) och medarbetare. Dessa antigener inkluderar 251 totalt ha antigener, med 63 klotformig huvuddomäner (HA1) och 186 fullängds proteiner (HA0), inklusive 96 monomer HA0 proteiner och 90 trimerized HA0 proteiner som innehåller smält trimerization ("foldon") domän23. En fullständig förteckning över antigener och kontroller som används i denna studie ingår som en kompletterande fil. För denna studie, sekundära antikroppar som används var get anti-humant IgG konjugerat till Quantum dot avger vid 800 nm (GAH-IgG-Q800) och get anti-human IgA konjugerat till Quantum dot avger vid 585 nm (GAH-IgA-Q585) för multiplex detektion av IgG och IgA antikroppar som visas i figur 3. IgG-och IgA-antikroppbindning till olika subtyper och molekylära former av influensa-HA-antigener jämfördes för serum som erhållits från den kliniska kohort som beskrivits ovan.
Den resulterande värme kartan visas i figur 4 med grafisk representation i figur 5. I dessa siffror är endast de kliniskt relevanta subtyperna med hög representation på matrisen märkta för att spara utrymme, med "+" som betecknar alla återstående subtyper av högre tal, och mindre eller mindre väl representerade undertyper som ingår som beställt (t. ex. H2 i mellan H1 och H3). En fullständig lista över stammar och undertyper på matrisen ingår som tilläggsfil. Dessa data visar att antikroppar mot huvudgruppen av HA är subtypspecifika med förväntad hög mängd antikroppar mot kliniskt utbredda stammar (H1N1, H3N2 och B) och låg mängd antikroppar mot andra stammar. Men, antikroppar mot hela HA, som omfattar stjälken domän, är mer Cross-reaktiva över subtyper, och denna effekt verkar vara förstärkt när hela HA är trimerized. Detta resultat är inte oväntat, eftersom hela hektar inkluderar Stem-regionen, som är mycket bevarad över subtyper. Därför kommer antikroppar mot hela HA-molekyler från icke-kliniska subtyper (t. ex. H5 och H7) sannolikt att representera anti-Stem-antikroppar som ursprungligen uppnåddes mot kliniska subtyper (t. ex. H1 och H3) som korsreagerar med stamregionerna i de andra HA-subtyperna på matrisen. Denna punkt illustrerar vikten av att inkludera både Head HA och hela molekyl HA på matrisen för att skilja mellan antikroppar mot huvudet och Stem-regionerna som visar olika reaktivitetsprofiler.
Analysen visar god reproducerbarhet över sondering körningar. Den andra körningen visar något lägre IgG-antikroppar över alla stammar, även om mönstret mellan stammarna är konsekvent. Denna mindre minskning är sannolikt på grund av variation i den sekundära antikroppen, som ändrades mellan körningar för IgG men inte för IgA. Som nämnts i protokollet rekommenderas därför att använda samma sats av varje sekundär antikropp för alla experiment mellan vilka kvantitativ jämförelse planeras. Om olika partier av antikroppar är nödvändiga på grund av ett stort antal prover som skall testas, vi rekommenderade inklusive delade prover mellan experimentella körningar med olika antikroppar partier för att möjliggöra kvantitativ jämförelse med korrigering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk av proteinmikroarray. Varje bild innehåller flera kuddar vardera med en enda matris, som består av hundratals antigener tryckt på platser ordnade i ett rutnät, med varje plats som innehåller en antigen adsorberat på 3-dimensionell topografi av nitrocellulosa yta som antikroppar från serum binds. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig2.jpg"> Figur 2: schematiskt av influensa antigen microarray Printing och sondering Protocol. Från vänster till höger, microarray skrivs ut med hjälp av nitrocellulosabaserade diabilder, som används för att sond serum för IgG-och IgA-antikroppar med hjälp av Quantum-dot-konjugerade sekundära antikroppar, med diabilder avbildade med en bärbar Imager, och resultat analyseras för att Generera en värmekarta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig3.jpg"> Figur 3: förfarande för att fästa sondering kammare till microarray Slide. Från A till Fplaceras sondering-avdelningen ovanpå bilden i korrekt orientering, fäst på bilden med hjälp av horisontella klipp på sidorna och placerad i sondering facket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig4.jpg"> Figur 4: representativa resultat av mikroarray med influensa antigen. Värmekartor representerar antigen-specifika antikroppssvar, med varje rad som representerar en enda antigen som arrangeras av molekyl, subtyp och stam, och varje kolumn som representerar en sondering av ett enda prov, anordnad av antikropp isotyp och kör (a, vit = 0, svart = 20000, röd = 40000 fluorescensintensitet). Antigen subtyperna inklusive alla hemagglutinin subtyper från 1 till 18 och alla neuraminidastyp subtyper från 1 till 10 är ordnade vertikalt och märkta till vänster. En jämförelse av fluorescensintensiteten mellan två körningar visar god analys reproducerbarhet genom linjär regression för IgA (B) och IgG (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig5.jpg"> Figur 5: bredd av serumantikroppar mätt på mikroarray med influensa antigen. Serum IgA (A) och IgG (B) grupperas efter ha-och na-molekyl former och subtyper för att påvisa hög specificitet hos ha-toppgrupp-antikroppar för kliniska subtyper och hög kors reaktivitet av hela ha och trimeriserade hela ha-antikroppar med inkludering av stjälk regionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tilläggsfil: lista över antigener på mikroarray med influensa antigen. Innehållet visas för alla 324 fläckar på matrisen, inklusive ämnen, fiducials, kontroller (humant IgG och IgA och anti-humant IgG och IgA på 0,1 mg/mL och 0,3 mg/mL), och antigener med information om källa, molekylär form, subtyp, och stam. Förkortningar är följande: för källa, Sino = Sino Biological Inc., FKL = Florian Krammer laboratorium; för molekylär form, HA1 = huvud HA, HA0 = hela HA, HA2 = stjälk HA, NP = nukleoprotein. För antigener som kommer från Sino Biological Inc. visas katalognummer. för antigener som kommer från Krammers laboratorium listas antigen-ID: n. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/Supplementary_File.xlsm">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes at JoVE.com

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

Vi presenterar ett protokoll för att använda en proteinmikroarray konstruerad genom att skriva ut influensa antigener på nitrocellulosabaserade diabilder för att samtidigt sond serum för flera antikropp isotyper mot över 250 antigener från olika virusstammar, vilket möjliggör mätning av bredden av serumantikroppar över virus subtyper.

Användning av en mikroarray med influensa antigen för att mäta bredden av serum antikroppar över virus subtyper

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Influensaantigenmikrorayen möjliggör samtidig mätning av multipla antikroppsisotyper mot mer än 300 stammar av influensa från en liten blodprovsvolym på bara en mikroliter. Mikroarrayen underlättar en mätning med hög genomströmning av bredden av influensaantikropparna i influensastammarnas antigena landskap. Genom att karakterisera influensa antikroppar mer i detalj än vad som tidigare hade varit möjligt, kan denna microarray hjälpa till att avgöra varför vissa människor utvecklar en influensainfektion och andra inte.Antigen microarray tekniken har tillämpats på 35 olika patogener i vårt laboratorium, vilket möjliggör mätning av antikroppar mot 60, 000 antigen mål och från 50, 000 serum exemplar som samlats in från infektionssjukdomar fall och friska kontroller över hela världen. Efter att ha undervisat denna teknik genom i-person workshops, har vi funnit att kunna visuellt visa tekniken är avgörande för dess förståelse och prestanda. Demonstrera förfarandet kommer att Al Jasinskas och Rafael De Assis, projektforskare från vårt laboratorium.För att skriva ut antigener med hjälp av en microarray skrivare, välj en skrivare med låg volym microarray spotting stift som kan aspirera antigenerna från en 384-brunn källplatta i provet kanalen och deponera antigener via direkt kontakt och kapillärverkan på 16 pad nitrocellulosa belagda glas diabilder. I utskriftsprogrammet anger du antalet provskyltar som kommer att användas i textrutan för antal plattor och välj den skylttyp som ska användas för analysen. Välj en stiftkonfiguration och ställ in ursprungsförskjutningarna på avstånden mellan bildskärningen och den plats där utskriftsstiften ska börja skriva ut på bilderna.Under fliken för matrisdesign definierar du matrisernas storlek och form och väljer parametrarna för hur utskriftsstiften ska plocka upp och fördela proverna. Konfigurera protokollen för stiftrengöring och blotting och definiera den sekvens i vilken provblocken skrivs ut på bilderna. Array programvara kommer att konstruera en kommenterad rutnät indexfil för att beskriva arrangemanget av antigener inom varje microarray.Efter programmering av utskriftsprogramvaran med önskat protokoll, starta utskriftskörningen. När den är klar, placera unprobed microarray diabilder i en ljus-bevis låda i en exsiccator skåp vid rumstemperatur. För att sond sera för antikroppar på microarray, använd clips för att fästa microarray diabilder pad sida upp på probing kamrarna och placera kamrarna i ramarna.Var försiktig när du monterar objektglasen, eftersom de lätt bryts och kontrollerar om eventuellt läckage efter rehydrering. Ta isär och montera ihop objektglasen igen för att åtgärda läckor. Rehydrera objektglasen med 100 mikroliter av filtrerad blockerande buffert per brunn och späd sera i ett till 100 förhållande i 100 mikroliter av blockerande buffert per prov.Därefter inkuberar de rehydrerade mikroarraysglasen och den utspädda seraen i 30 minuter vid rumstemperatur och 100 till 250 rotationer per minut på en orbitalskak. I slutet av inkubationen, använd pipettspetsar som är anslutna till en vakuumlina med en sekundär uppsamlingskolv för att försiktigt aspirera blockeringsbufferten från varje kammares hörn utan att vidröra dynorna och tillsätt omedelbart den utspädda seraen till dynorna utan att padsen får torka. Placera sedan de täckta ramarna i brickor som innehåller fuktiga pappershanddukar förseglade för att bibehålla luftfuktigheten och inkubera ramarna över natten vid fyra grader Celsius på en gungande skakmaskin.För quantum dot konjugerad sekundär antikropp märkning, försiktigt aspirera sera som just visat och skölja objektglasen med tre tvättar i 100 mikroliter av färska TTBS buffert per brunn i fem minuter vardera på en orbital shaker. Objektglasen inkuberas sedan med en blandning av kvantprickkonjugerade sekundära antikroppar och tvättas sedan tre gånger enligt beskrivningen i protokollet, med samma teknik som just visats. Efter den sista tvätten, ta försiktigt bort objektglasen från kamrarna och skölj försiktigt objektglasen med filtrerat dubbeldestillerat vatten och lägg sedan varje objektglas i ett 50 milliliterrör.Torka sedan objektglasen genom centrifugeringen. För att skaffa bilder av mikroarraybilderna, slå först på den bärbara imagern och placera försiktigt bilden som ska avbildas med ansiktet nedåt i bildhållaren i bildkammaren. Öppna bildhanteringsprogrammet och under fliken konfigurera bildark, välj lämplig bildkonfiguration.Under bildkontrollfliken väljer du lämplig lysrörskanal och justerar exponerings- och förvärvstiderna beroende på seras reaktivitet. Klicka sedan på capture för att starta bildförvärvet. I slutet av förvärvet, använd de galler som är orienterade på fiducialmarkörerna för att upptäcka matrisfläckarna.För att mäta dekorintensiteten, i filinfopanelen, ladda upp gal-filen och ange mappen där analysutdatafilerna ska sparas i avsnittet med analysalternativ. Under fliken bildkontroll öppnar du en av de förvärvade bilderna som ska kvantifieras och välj auto. I matrisanalysavsnittet skapar du en fiducialmall enligt programvarornas instruktioner.Klicka på batchanalys för att välja den mapp som innehåller de bilder som ska kvantifieras och välj den fiducialmall som just skapades. Programvaran kommer att analysera varje bild och kvantifiera spotintensiteten. Analysera sedan rådata för att jämföra antikroppsbindningen över antigener och över serumprover.I denna representativa studie var de sekundära antikroppar som användes Get Anti-Human IgG konjugerad till kvantpricka som avger vid 800 nanometer och Goat Anti-Human IgA konjugerad till kvantpricka som avger vid 585 nanometer för multiplexdetektering av IgG och IgA antikroppar respektive. I den resulterande värme kartan, endast de kliniskt relevanta subtyper med hög representation var märkt att spara utrymme med plus-tecknet betecknar alla de återstående undertyperna av ett högre antal. Serum IgA och IgG grupperades av deras hemagglutinin och neuraminidas molekylära former och subtyper.För att visa den höga specificiteten hos den hemagglutinin huvudgruppen antikroppar för de kliniska subtyper och den höga cross-reactivity av hela hemagglutinin och triamerized hela hemagglutinin antikroppar med införandet av beståndet regionen. Influensaantikroppssvar som mäts på mikroarrayen kan bekräftas med traditionella tekniker, inklusive hemagglutinationshämning och mikroneutraliseringsanalyser. Denna teknik har gett insikter i subtypse specificiteten hos antikroppar mot gruppen med influensahuvud och den relativa betydelsen av IgA- och IgG-antikroppar mot influensans mottaglighet.Inget av materialen är extremt farliga, men alla humana serumprover bör hanteras i enlighet med institutionella biosäkerhetsprotokoll.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX Kolorimetriska Detection på en DNA microarray för influensa

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Snabb diagnos av aviär influensavirus hos vilda fåglar: Användning av en bärbar RRT-PCR och Frystorkad reagenser i Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av Mouse Mx1 Protein med influensa A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes för influensa A-virus Upptäckt och isolering från svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

En miniatyriserad glykan microarray analys för bedömning Aviditet och specificitet av influensa A-virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...