Name: lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

S. S. blev støttet af en amerikansk hjerte forening postdoc Fellowship 17POST33670076. K. W. blev støttet af NIH Grants R01 HL138014, R01 HL141256 og R01 HL139819.

Alle procedurer, der involverer dyreforsøg, er blevet godkendt af Udvalget for institutions dyreomsorg og-anvendelse (IACUC) ved University of Virginia.
1. produktion og rensning af lentivirus partikler
Bemærk: lentivirus partikler, der indeholder den optimerede guide RNA kan produceres af de detaljerede protokoller, der leveres af Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. Optimerede metoder til højtiter lentiviru...

<ol>
	<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells.">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li><li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+vav,+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment.">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li><li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid,+Spontaneous,+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia.">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia.">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease.">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li><li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells:+size+matters.">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li><li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL/6+Cas9+transgenic+mouse+line.">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta/NLRP3+Inflammasome.">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease.">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation.">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875 (2015).</li><li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells.">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations.">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li><li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements.">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li><li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis:+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease.">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li><li>Kahn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPM1D+truncating+mutations+confer+resistance+to+chemotherapy+and+sensitivity+to+PPM1D+inhibition+in+hematopoietic+cells.">PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells.</a> Blood. , (2018).</li></ol>

Fordelen ved denne protokol er skabelsen af dyremodeller, der harkedeligt specifikke mutationer i hæmatopoietiske celler på en hurtig og meget omkostningseffektivmåde i forhold til konventionelle mus transgene tilgange. Det blev konstateret, at denne metode muliggør generering af mus med hæmatopoietiske celle genmanipulationer inden for 1 måned. Der er flere kritiske trin i denne protokol, der kræver yderligere overvejelse.
Screening af gRNA sekvens
<p class="jove_c...

Mange undersøgelser i hæmatologi og Immunologi er afhængige af tilgængeligheden af genetisk modificerede mus, herunder konventionelle og betingede transgene/knock-out mus, der udnytter hæmatopoietiske system-specifikke CRE drivere såsom Mxcre, VAV-CRE, og andre 1,2,3,4,5. Disse strategier kræver etablering af nye muse stammer, som kan være tidskrævende og økonomisk byrde. Mens revolutionerende fremskridt i genomredigerings teknologien har muliggjort generering af nye muse stammer i så få som 3-4 måneder med den relevante tekniske ekspertise6,7,8,9 , er der brug for meget mere tid til at forstærke muse kolonien, før eksperimenter forfølges. Desuden er disse procedurer dyre. For eksempel, Jackson laboratorium lister den nuværende pris på knock-out mus generation tjenester på $16.845 per stamme (pr. december 2018). Således, metoder, der er mere økonomisk og effektiv end konventionelle murine transgene tilgange er mere fordelagtige.
Grupperet jævnligt hinanden korte palindromiske gentagelser/crispr Associated protein 9 (crispr/Cas9) teknologi har ført til udvikling af nye værktøjer til hurtig og effektiv RNA-baseret, sekvens-specifik genomredigering. Det blev oprindeligt opdaget som en bakteriel adaptiv immun mekanisme til at ødelægge invaderende patogen DNA, CRISPR/Cas9-systemet er blevet brugt som et redskab til at øge effektiviteten af genomredigering i eukaryotiske celler og dyremodeller. En række tilgange har været anvendt til at overføre CRISPR/Cas9 maskiner til hæmatopoietiske stamceller (dvs., elektro poration, nukleofection, lipofection, viral levering, og andre).
Her er et lentivirus system ansat til at transduce celler på grund af dets evne til effektivt at inficere Cas9-udtrykker murine hæmatopoietiske stamceller og pakke sammen guide RNA udtryk konstruere, initiativtagere, lovgivningsmæssige sekvenser, og gener, der indkode fluorescerende reporter proteiner (dvs. GFP, RFP). Ved hjælp af denne metode, ex vivo gen redigering af mus hæmatopoietiske stamceller er blevet opnået, efterfulgt af vellykket rekonstitution af knoglemarv i letbestrålede mus10. Den lentivirus vektor, som er ansat i denne undersøgelse, udtrykker Cas9-og GFP reporter-generne fra Common Core EF1a-promotoren med et internt ribosomale indgangssted opstrøms fra reporter-genet. Guide-RNA-sekvensen udtrykkes fra en separat U6-promotor. Dette system bruges derefter til at skabe indsættelse og sletning mutationer i kandidat klonal hematopoiese driver gener Tet2 og Dnmt3a10. Imidlertid er transduktiviteten ved denne metode forholdsvis lav (~ 5%-10%) på grund af den store størrelse af vektor indsatsen (13 KBP), der begrænser transduktiviteten og reducerer virus titer under produktionen.
I andre undersøgelser, det har vist sig, at større viral RNA størrelse negativt påvirker både virus produktion og transduktivitet effektivitet. For eksempel, en 1 kb stigning i Indsæt størrelse er rapporteret at reducere virus produktion af ~ 50%, og transduktivitet effektivitet vil falde til mere end 50% i mus hæmatopoietiske stamceller11. Således er det fordelagtigt at reducere størrelsen af den virale indsats så meget som muligt for at forbedre effektiviteten af systemet.
Denne mangel kan overvindes ved at ansætte Cas9 Transgene mus, hvor det Cas9 protein udtrykkes i enten en konstitutiv eller inducerbar måde12. De konstitutive crispr/Cas9 Knock-in-mus udtrykker Cas9 endonuklease og egfp fra CAG-promotoren på Rosa26 locus på en allestedsnærværende måde. Således kan en konstruktion med sgrna under kontrol af U6 promoter og RFP reporter-genet under kontrol af Core EF1a Promoter leveres ved hjælp af lentivirus-vektoren for at opnå genom-redigering. Med dette system, generne af hæmatopoietiske stamceller er blevet redigeret med succes, viser en ~ 90% transduktionseffektivitet. Således, denne protokol giver en hurtig og effektiv metode til at oprette mus, hvor målrettede genmutationer indføres i det hæmatopoietiske system. Mens vores laboratorium overvejende bruger denne type teknologi til at studere rollen som klonal hematopoiese i hjerte-kar-sygdomme processer13,14,15, det gælder også for undersøgelser af hæmatologiske malignitet16. Desuden kan denne protokol udvides til at omfatte en analyse af, hvordan DNA-mutationer i HSPC påvirker andre sygdoms-eller udviklingsmæssige processer i det hæmatopoietiske system.
At etablere en robust lentivirus vektorsystem, høj titer virale bestande og optimerede betingelser for transduktion og transplantation af hæmatopoietiske celler er påkrævet. I protokollen gives der instruktioner om fremstilling af en høj titer viral bestand i afsnit 1, optimering af dyrkningsbetingelserne for murine hæmatopoietiske stamceller i afsnit 2, metoder til knoglemarvstransplantation i afsnit 3, og vurdering af i afsnit 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:936px;" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td style="width:159px;">EXELINT</td>
			<td style="width:113px;">26028</td>
			<td style="width:150px;">general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216--</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560599</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552094</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365974</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 18 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 22 G&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:159px;">Biolegend</td>
			<td style="width:113px;">100752</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100349</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9007-34-5</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">CRISPR/Cas9 knock-in mice</td>
			<td style="width:159px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:113px;">028555</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>352054</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&#160;</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>353046</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand microhematocrit capillary tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:113px;">11-0042-85</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554655</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td>
			<td style="width:159px;">Clontech</td>
			<td style="width:113px;">632636</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X qRT-PCR Titration Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV004SL</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1152-82</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI MAX</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560602</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>57823</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMG2D</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polybrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>326823</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine TPO&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>315-14</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemSpan SFEM</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>09600</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:159px;">Thermo fisher Scientific</td>
			<td>K457501</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Solution&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models

Manipulere gener i hæmatopoietiske stamceller ved hjælp af konventionelle transgenese tilgange kan være tidskrævende, dyrt, og udfordrende. Ved at drage fordel af fremskridt inden for genomredigerings teknologi og lentivirus medierede transgenleveringssystemer er en effektiv og økonomisk metode beskrevet her, der etablerer mus, hvor gener manipuleres specifikt i hæmatopoietiske stamceller. Lentivira bruges til at Trans Cas9-udtrykke Lineage-negative knoglemarvsceller med en guide RNA (gRNA) rettet mod specifikke gener og et rødt fluorescens reporter-gen (RFP), så disse celler transplanteres til letalt bestrålede C57BL/6-mus. Mus transplanteret med lentivirus udtrykker ikke-målretning gRNA anvendes som kontrol. Engraftment af transducerede hæmatopoietiske stamceller evalueres ved flow cytometrisk analyse af RFP-positive leukocytter af perifert blod. Ved hjælp af denne metode, ~ 90% transduktion af myeloide celler og ~ 70% af lymfoide celler ved 4 uger efter transplantation kan opnås. Genomisk DNA isoleres fra RFP-positive blodlegemer, og dele af det målrettede site DNA forstærkes af PCR for at validere genomredigeringen. Denne protokol giver en høj gennemløb evaluering af hæmatopoiesis-regulerende gener og kan udvides til en række muse sygdomsmodeller med hæmatopoietisk celle involvering.

Ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol er der opnået ca. 0,8-1,0 x 108 knoglemarvsceller pr. mus. Antallet af Lineage-negative celler, vi opnår, er ca. 3 x 106 celler pr. mus. Typisk er udbyttet af knoglemarv Lineage-negative celler 4%-5% af den samlede knoglemarv nukleare celler.
Chimerisme af transducerede celler (RFP-positive) evalueres ved strømnings cytometri af det perifere blod (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Beskrevet er protokoller for den yderst effektive genomredigering af murine hematopoietisk stamceller og progenitorcellerne (HSPC) af CRISPR/Cas9 systemet til hurtigt at udvikle musemodel systemer med hæmatopoietiske systemspecifikke genmodificeringer.

Lentiviral CRISPR/Cas9-medieret genomredigering til studiet af hæmatopoietiske celler i sygdomsmodeller

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Vi har udviklet en effektiv og økonomisk metode til at etablere mus med genmanipulation specifikt i hæmatopoietiske stamceller, Ved hjælp af genom redigeringsteknologi og lentivirus-medieret transgene leveringssystemer. Fordelen ved denne protokol er, at vi kan skabe dyremodeller, der huser specifikke mutationer i hæmatopoietiske celler på en hurtig og omkostningseffektiv måde sammenlignet med konventionelle musetransgene tilgange. Demonstration af proceduren vil være Ying Wang, en forsker fra mit laboratorium.At generere lentivirus partikler, starte med at kode en seks godt plade med kollagen opløsning og inkubere det ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 30 minutter. Derefter frø 293T celler på pladen og inkubere det i yderligere to timer. I mellemtiden forberede blandingen af tre transfektion plasmider ved at kombinere 0,9 mikrogram lentivirus vektor, 0,6 mikrogram psPAX2 og 0,3 mikrogram pMD2.G og deioniseret til 10 mikroliter pr brønd. Derefter tilsættes forsigtigt 50 mikroliter af 1X PBS og fem mikroliter af fortyndet PEI MAX til plasmid blandingen, og inkubere blandingen ved stuetemperatur i 15 minutter. Efter inkubationen tilsættes en milliliter DMEM.Aspirere medierne fra de seks brøndplade og tilsæt en milliliter plasmid blanding til hver brønd. Inkuber pladen i yderligere tre timer. Udskift mediet med frisk DMEM og inkuber i 24 timer.Tilsæt en milliliter frisk DMEM og inkuber yderligere 24 timer. Efter total 48 timers inkubation overføres supernatanten til et 50 milliliterrør og centrifugeres ved 3000 gange G i 15 minutter for at fjerne eventuelle fritsvævende celler. Supernatanten filtreres gennem et 0,45 mikrometerfilter og ultracentrifuge det i tre timer.Inspirer forsigtigt supernatanten og efterså forsigtigt den hvide pellet. Re-suspendere pellet med 100 mikroliter af serum-fri hæmatopoietisk celle ekspansion medium uden beboelse. Hold en 10 mikroliter aliquot at måle den virale titer og gemme resten af suspensionen på minus 80 Celsius indtil klar til brug.Efter isolering af knoglerne anbringes de i et konisk rør på 50 milliliter med RPMI, og røret anbringes på is. I et biosikkerhedsskab skal knoglerne overføres til en steril 100 millimeter kulturskål. Derefter gribe en knogle med stumpe kraftafkræfter, og bruge dissektion saks til omhyggeligt at skære begge epifyser.Fyld en 10 milliliter sprøjte med iskold RPMI og bruge en 22 gauge nål til at skylle knoglemarven fra akslen i en ny 100 millimeter kultur parabol. Når alle knoglemarven er indsamlet, lave en enkelt celle suspension ved at passere knoglemarven gennem en 10 milliliter sprøjte med en 18 gauge nål. Celleophænget filtreres gennem en 70 mikrometercelles si i et konisk rør på 50 milliliter.Derefter centrifuge røret i henhold til manuskriptet retninger og aspirere supernatant. Re-suspendere celle pellets i en passende volumen af optimeret adskillelse buffer. For at isolere afstamning negative celler, skal du bruge en afstamning celle udtynding kit i henhold til producentens anvisninger.Re-suspendere den isolerede afstamning negative celler i serum-fri hæmatopoietiske celle ekspansion medium. Præ-inkubere cellerne ved 37 grader celsius i 5% kuldioxid i to timer. Derefter tilsættes lentivirus i henhold til manuskriptet retninger og lad cellerne i inkubatoren i yderligere 16 til 20 timer.Den næste dag, indsamle lentivirus-transduced celler i en 15 milliliter konisk rør og centrifuge dem på 300 gange G i 10 minutter. Ifølge NHA retningslinjer, Er det vigtigt at håndtere lentivirus vektorer på Reece Group niveau to. Der skal træffes forholdsregler på grundlag af facilitetsreglerne.Inspirer forsigtigt supernatanten og genspærr pellet i 200 mikroliter RPMI pr. mus. Hold cellerne ved stuetemperatur, indtil de er blevet kåret til mus. Efter den anden bestrålingssession indsprøjtes retro-orbitalt transduced delineage negative celler i hver bedøvet mus ved hjælp af en insulinsprøjte.Tre til fire uger efter knoglemarvstransplantation, få blodprøver fra retro-orbital vene ved hjælp af kapillære rør. Overfør 20 mikroliter blod i rundbundet polystyren reagensglas og sted på is. Efter RBC lysis, inkubere cellerne med en cocktail af monoklonale antistoffer i mørke i 20 minutter ved stuetemperatur.Efter inkubation vaskes, fikses og centrifugeres cellerne, og cellepellet suspenderes igen i 400 mikroliter af FACS-buffer. Hold prøverne på fire grader Celsius, indtil analyse af flow cytometri. Succes af afstamning negativ celle transduktion kan evalueres med flow cytometrisk detektion af RFP.Det er blevet påvist, at efter syv dages in vitro-kultur transeksuceres i gennemsnit 75,7 % af cellerne. Flow cytometri er også blevet brugt til at analysere mus perifert blod efter rekonstitution med transduced og ikke-transduced hæmatopoietiske stamceller. Et gennemsnit på 94,8% af neutrofiler, 93,5% af monocytter, og 82,7% af B-celler udtrykke RFP.Genomisk DNA fra RFP-positive blodlegemer er blevet PCR forstærket og sub-klonet til sekvensanalyse. Forskellige mutationer opdages og 69% af klonerne viser ud af rammen eller for tidligt stop mutationer. For at lykkes med denne procedure, forberedelse af høje antivirus lager og optimerede betingelser for transduktion og transplantation af hæmatopoietiske celler er påkrævet.Vi har anvendt denne teknik til at studere loven i i hjerte-kar-sygdom. Men det er også nyttigt at studere hæmatologisk malignitet. Denne metode gør det muligt for os at studere funktionerne af nye typer af gener i hæmatopoietisk system i høj effektiv og høj måde.Vi samler dette over tilgængeligheden af transgene mus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Samtidig infektion model for at studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions i humane primære Monocytafledte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering af en Liquid-dækket kultur Polarized humane luftveje Epitelial Calu-3-celler til at studere Host celle respons på luftvejspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere udviklingen i murine Plasmacytoid dendritiske celler i Peyer&#39;ske Patches Brug adoptiv overførsel af Hematopoietic Progenitorer

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratrakeal administration<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; I musemodeller at studere Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...