Name: lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

S. S. werd gesteund door een Amerikaanse hart vereniging Postdoctoral Fellowship 17POST33670076. K. W. werd ondersteund door NIH subsidies R01 HL138014, R01 HL141256, en R01 HL139819.

Alle procedures met betrekking tot dierproef personen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Virginia.
1. opwekking en zuivering van lentivirusdeeltjes
Opmerking: Lentivirusdeeltjes met de geoptimaliseerde handleiding RNA kunnen worden geproduceerd door de gedetailleerde protocollen die door Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. De geoptimaliseerde ...

<ol>
	<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells.">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li><li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+vav,+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment.">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li><li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid,+Spontaneous,+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia.">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia.">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease.">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li><li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells:+size+matters.">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li><li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL/6+Cas9+transgenic+mouse+line.">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta/NLRP3+Inflammasome.">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease.">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation.">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875 (2015).</li><li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells.">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations.">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li><li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements.">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li><li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis:+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease.">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li><li>Kahn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPM1D+truncating+mutations+confer+resistance+to+chemotherapy+and+sensitivity+to+PPM1D+inhibition+in+hematopoietic+cells.">PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells.</a> Blood. , (2018).</li></ol>

Het voordeel van dit protocol is de creatie van diermodellen die specifieke mutaties in hematopoietische cellen in een snelle en zeer kosteneffectieve manier verteren in vergelijking met conventionele muis transgene benaderingen. Bleek dat deze methodologie maakt het genereren van muizen met hematopoietische cel gen-manipulaties binnen 1 maand. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die verder moeten worden overwogen.
Screening van de gRNA-sequentie
<p clas...

Veel studies in hematologie en immunologie vertrouwen op de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizen, met inbegrip van conventionele en voorwaardelijke transgene/knock-out muizen die gebruik maken van hematopoietische systeemspecifieke CRE drivers zoals Mxcre, vav-CRE, en anderen 1,2,3,4,5. Deze strategieën vereisen de oprichting van nieuwe muis stammen, die tijdrovend en financieel belastend kunnen zijn. Terwijl revolutionaire ontwikkelingen in de genoom Editing technologie het genereren van nieuwe muis stammen in slechts 3-4 maanden mogelijk hebben gemaakt met de juiste technische expertise6,7,8,9 , veel meer tijd is nodig om de muis kolonie te versterken voordat experimenten worden nagestreefd. Bovendien zijn deze procedures kostbaar. Bijvoorbeeld, Jackson laboratorium vermeldt de huidige prijs van knock-out mice generatie diensten op $16.845 per stam (vanaf december 2018). Daarom zijn methodes die zuiniger en efficiënter zijn dan conventionele Murine transgene benaderingen voordeliger.
Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9) technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe tools voor snelle en efficiënte RNA-gebaseerde, sequentie-specifieke genoom bewerking. Oorspronkelijk ontdekt als een bacteriële adaptieve immuun mechanisme om het binnenvallende pathogeen DNA te vernietigen, is het CRISPR/Cas9 systeem gebruikt als een instrument om de effectiviteit van genoom bewerking in eukaryote cellen en diermodellen te verhogen. Er zijn een aantal benaderingen toegepast om CRISPR/Cas9-machines te verzenden naar hematopoietische stamcellen (d.w.z. elektroporatie, nucleofectie, lipofectie, virale levering en andere).
Hier wordt een lentivirussysteem gebruikt om cellen te leiden als gevolg van zijn vermogen om de Cas9-uitzinnige muriene hematopoietische stamcellen effectief te infecteren en samen de RNA-expressie constructie, promoters, regelgevings sequenties en genen die coderen fluorescerende reporter eiwitten (d.w.z. GFP, RFP). Met behulp van deze methode is ex vivo genbewerking van hematopoietische stamcellen van de muis bereikt, gevolgd door een succesvolle reconstitutie van het beenmerg in dodelijk bestraalde muizen10. De lentivirus vector die voor deze studie wordt gebruikt, toont de Cas9 en GFP reporter genen van de common core EF1a Promoter met een interne ribosomale intrede site stroomopwaarts van het reporter gen. De gids RNA-sequentie wordt uitgedrukt uit een afzonderlijke U6-promotor. Dit systeem wordt vervolgens gebruikt voor het maken van inbrengen en verwijderen mutaties in de kandidaat klonale Hematopoiesis bestuurder genen Tet2 en Dnmt3a10. Echter, de transductie-efficiëntie door deze methode is relatief laag (~ 5%-10%) door het grote formaat van de vector insert (13 KBP) die de transductie-efficiëntie beperkt en de virus titer vermindert tijdens de productie.
In andere studies, het is aangetoond dat grotere virale RNA grootte negatief beïnvloedt zowel de virus productie en transductie efficiëntie. Bijvoorbeeld, een toename van 1 KB in wisselplaatgrootte wordt gerapporteerd aan de virus productie te verlagen door ~ 50%, en transductie-efficiëntie zal afnemen tot meer dan 50% in de muis hematopoietische stamcellen11. Het is dus voordelig om de grootte van de virale insert zoveel mogelijk te verminderen om de efficiëntie van het systeem te verbeteren.
Deze tekortkoming kan worden overwonnen door het gebruik van Cas9 transgene muizen, waarbij het Cas9-eiwit wordt uitgedrukt in een constitutieve of niet-industriële manier12. De constitutieve CRISPR/Cas9 knock-in muizen drukt Cas9 endonuclease en EGFP uit van de CAG-promotor op de Rosa26 locus op een alomtegenwoordige manier. Zo kan een constructie met sgRNA onder controle van de promotor en RFP reporter gene onder de controle van de core EF1a promotor worden geleverd met behulp van de lentivirus vector om genoom bewerking te bereiken. Met dit systeem, de genen van hematopoietische stamcellen zijn met succes bewerkt, tonen een ~ 90% transductie efficiëntie. Dit protocol biedt dus een snelle en effectieve methode om muizen te creëren waarin gerichte genmutaties in het hematopoietische systeem worden geïntroduceerd. Terwijl ons lab is voornamelijk met behulp van dit soort technologie te bestuderen van de rol van van klonen Hematopoiesis bij cardiovasculaire ziekteprocessen13,14,15, het is ook van toepassing op studies van hematologische maligniteiten16. Bovendien kan dit protocol worden uitgebreid tot de analyse van de invloed van DNA-mutaties in HSPC op andere ziekte-of ontwikkelingsprocessen in het hematopoietische systeem.
Om een robuust lentivirus vector systeem te vestigen, zijn hoge titer virale voorraden en geoptimaliseerde omstandigheden voor de transductie en transplantatie van hematopoietische cellen vereist. In het protocol worden instructies gegeven over de bereiding van een hoog titer-virale bestanddeel in rubriek 1, waarbij de cultuuromstandigheden van de erytrocyten hematopoietische stamcellen in rubriek 2, de methoden voor beenmergtransplantatie in rubriek 3, worden geëvalueerd en engraftment in rubriek 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:936px;" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td style="width:159px;">EXELINT</td>
			<td style="width:113px;">26028</td>
			<td style="width:150px;">general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216--</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560599</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552094</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365974</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 18 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 22 G&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:159px;">Biolegend</td>
			<td style="width:113px;">100752</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100349</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9007-34-5</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">CRISPR/Cas9 knock-in mice</td>
			<td style="width:159px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:113px;">028555</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>352054</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&#160;</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>353046</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand microhematocrit capillary tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:113px;">11-0042-85</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554655</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td>
			<td style="width:159px;">Clontech</td>
			<td style="width:113px;">632636</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X qRT-PCR Titration Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV004SL</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1152-82</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI MAX</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560602</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>57823</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMG2D</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polybrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>326823</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine TPO&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>315-14</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemSpan SFEM</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>09600</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:159px;">Thermo fisher Scientific</td>
			<td>K457501</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Solution&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models

Het manipuleren van genen in hematopoietische stamcellen met conventionele Transgenese benaderingen kan tijdrovend, duur en uitdagend zijn. Met het voordeel van de vooruitgang in de genoom Editing technologie en lentivirusgemedieerde transgen toedieningssystemen, wordt hier een efficiënte en economische methode beschreven die muizen vastlegt waarin genen specifiek worden gemanipuleerd in hematopoietische stamcellen. Lentivirussen worden gebruikt om Cas9-uitverkorende Lineage-negatieve beenmergcellen te leiden met een RNA-gelei (gRNA) gericht op specifieke genen en een rood fluorescentie reporter-gen (RFP), waarna deze cellen worden getransplanteerd in dodelijk bestraalde C57BL/6 muizen. Muizen die worden getransplanteerd met lentivirus die niet-gerichte gRNA uitdrukken, worden gebruikt als besturingselementen. Engraftment van getransduceerde hematopoietische stamcellen wordt geëvalueerd door flowcytometrische analyse van RFP-positieve leukocyten van perifeer bloed. Met behulp van deze methode, ~ 90% transductie van myeloïde cellen en ~ 70% van lymfoïde cellen na 4 weken na transplantatie kan worden bereikt. Genomisch DNA is geïsoleerd van RFP-positieve bloedcellen, en delen van het doelwit van het DNA van de site worden versterkt door PCR om de genoom bewerking te valideren. Dit protocol biedt een evaluatie van de hoge doorvoer van Hematopoiesis-regelgevende genen en kan worden uitgebreid naar een verscheidenheid van muis ziekte modellen met hematopoietische celbetrokkenheid.

Met behulp van het hierboven beschreven protocol zijn ongeveer 0,8-1,0 x 108 beenmergcellen per muis verkregen. Het aantal Lineage-negatieve cellen die we verkrijgen is ongeveer 3 x 106 cellen per muis. Typisch, de opbrengst van beenmerg Lineage-negatieve cellen is 4%-5% van die van totale beenmerg kern cellen.
Het chimerisme van getransduceerde cellen (RFP-positief) wordt geëvalueerd door Flowcytometrie v...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

We hebben een efficiënte en economische methode ontwikkeld om muizen met genmanipulatie specifiek in hematopoietische stamcellen vast te stellen, met behulp van genoombewerkingstechnologie en lentivirus-gemedieerde transgene leveringssystemen. Het voordeel van dit protocol is dat we dierlijke modellen kunnen maken die specifieke mutaties in hematopoietische cellen op een snelle en kosteneffectieve manier herbergen in vergelijking met conventionele transgene benaderingen van muizen. Het aantonen van de procedure zal Ying Wang, een onderzoeker van mijn laboratorium.Om lentivirusdeeltjes te genereren, begin met het coderen van een zes putplaat met collageenoplossing en het gedurende 30 minuten uitbroeden bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Dan, zaad 293T cellen op de plaat en uitbroeden voor nog eens twee uur. Bereid ondertussen het mengsel van drie transfectieplasmiden door 0,9 microgram lentivirusvector, 0,6 microgram psPAX2 en 0,3 microgram pMD2 te combineren.G en gedeïniseerd tot 10 microliter per put. Voeg vervolgens voorzichtig 50 microliter 1X PBS en vijf microliter verdunde PEI MAX toe aan het plasmidemengsel en ontcubeer het mengsel 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie een milliliter DMEM toe.Aspirate de media van de zes put plaat en voeg een milliliter plasmid mengsel aan elke put. Incubbateren de plaat voor nog eens drie uur. Vervang de media door verse DMEM en incubeer voor 24 uur.Voeg een milliliter verse DMEM toe en incubbate nog eens 24 uur. Na een totale incubatie van 48 uur breng je de supernatant over naar een buis van 50 milliliter en vercentrifugeer je het op 3000 keer G gedurende 15 minuten om alle vrij zwevende cellen te verwijderen. Filtreer de supernatant door een 0,45 micrometer filter en ultracentrifuge het gedurende drie uur.Zorgvuldig aspirate de supernatant, waardoor achter de witte pellet. Stel de pellet opnieuw op met 100 microliters serumvrije hematopoietisch celexpansiemedium zonder beademing. Houd een 10 microliter aliquot om de virale titer te meten en bewaar de rest van de suspensie op min 80 Celsius tot klaar voor gebruik.Na het isoleren van de botten, plaats ze in een 50 milliliter conische buis met RPMI en plaats de buis op ijs. Breng de botten in een bioveiligheidskast over in een steriele kweekschaal van 100 millimeter. Pak dan een bot met stompe tangen, en gebruik dissectie schaar om zorgvuldig snijden beide epifysen.Vul een spuit van 10 milliliter met ijskoude RPMI en gebruik een 22-meterige naald om het beenmerg uit de schacht door te spoelen in een nieuwe 100 millimeter kweekschotel. Nadat al het beenmerg is verzameld, maak een enkele cel suspensie door het beenmerg door een 10 milliliter spuit met een 18-meter naald. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter.Centrifugeer de buis vervolgens volgens de handschriftaanwijzing en aspirate de supernatant. Stel de celpellets opnieuw op in een passend volume van geoptimaliseerde scheidingsbuffer. Om afstamming negatieve cellen te isoleren, gebruik maken van een lineage cel uitputting kit volgens de instructies van de fabrikant.Schort de geïsoleerde afstammingnegatieve cellen opnieuw op in serumvrije hematopoietisch celexpansiemedium. Pre-incubeer de cellen op 37 graden celsius in 5%kooldioxide gedurende twee uur. Voeg vervolgens lentivirus toe volgens de aanwijzingen van het manuscript en laat de cellen nog 16 tot 20 uur in de couveuse staan.De volgende dag, verzamel de lentivirus-getransduceerde cellen in een 15 milliliter conische buis en centrifugeren ze op 300 keer G gedurende 10 minuten. Volgens de NHA-richtlijnen is het belangrijk om lentivirusvectoren te hanteren op Reece Group niveau twee. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen op basis van facilitaire voorschriften.De supernatant voorzichtig aanzuigen en de pellet opnieuw ophangen in 200 microliter RPMI per muis. Houd de cellen op kamertemperatuur tot transplantatie in muizen. Na de tweede bestraling sessie, retro-orbitaal injecteren getransduceerde afbakenende negatieve cellen in elke verdoofde muis met behulp van een insulinespuit.Drie tot vier weken na beenmergtransplantatie, krijgen bloedmonsters van de retro-orbitale ader met behulp van capillaire buizen. Breng 20 microliter bloed over in polystyreen reageerbuizen met ronde bodem en plaats op ijs. Na RBC lysis, incubeer de cellen met een cocktail van monoklonale antilichamen in het donker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Na incubatie, wassen, fixen en centrifugeren van de cellen en opnieuw opschorten de cel pellet in 400 microliters van FACS buffer. Bewaar de monsters op vier graden Celsius tot de analyse door de stroom cytometrie. Succes van afstamming negatieve cel transductie kan worden geëvalueerd met flow cytometrische detectie van RFP.Het is aangetoond dat na zeven dagen van in vitro cultuur, gemiddeld 75,7% van de cellen worden getransduceerd. Flow cytometrie is ook gebruikt om muis perifeer bloed te analyseren na reconstitutie met getransduceerde en niet-getransduceerde hematopoietische stamcellen. Gemiddeld 94,8% van de neutrofielen, 93,5% van de monocyten en 82,7% van de B-cellen drukken RFP uit.Genomic DNA van de RFP-positieve bloedcellen is PCR versterkt en sub-gekloond voor sequentie-analyse. Verschillende mutaties worden gedetecteerd en 69% van de klonen tonen out of frame of premature stop mutaties. Om met deze procedure te slagen, zijn de voorbereiding van hoge antivirusvoorraad en geoptimaliseerde voorwaarden voor transductie en transplantatie van hematopoietische cellen vereist.We hebben deze techniek toegepast om de wet van hart- en vaatziekten te bestuderen. Maar het is ook nuttig om hematologische maligniteit te bestuderen. Deze methode stelt ons in staat om de functies van nieuwe soorten genen in het hematopoietisch systeem op een hoge efficiënte en hoge manier te bestuderen.We verzamelen dit over de beschikbaarheid van transgene muizen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratracheale toediening van<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In muismodellen om te studeren luchtwegontsteking

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...