Name: lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

S. S. היה נתמך על ידי האגודה האמריקנית לצדק בתר-דוקטורט 17POST33670076. ק. ו. נתמך על ידי NIH מענקים R01 HL138014, R01 HL141256, ו R01 HL139819.

כל ההליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת וירג.
1. יצירה וטיהור של חלקיקי וירוס
הערה: לאחר חלקיקי וירוס המכילים את מדריך מיטבי RNA ניתן לייצר על ידי הפרוטוקולים המפורטים המסופקים על ידי Addgene: < https://media.addgene.or...

<ol>
	<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells.">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li><li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+vav,+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment.">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li><li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid,+Spontaneous,+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia.">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia.">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease.">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li><li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells:+size+matters.">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li><li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL/6+Cas9+transgenic+mouse+line.">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta/NLRP3+Inflammasome.">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease.">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation.">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875 (2015).</li><li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells.">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations.">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li><li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements.">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li><li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis:+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease.">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li><li>Kahn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPM1D+truncating+mutations+confer+resistance+to+chemotherapy+and+sensitivity+to+PPM1D+inhibition+in+hematopoietic+cells.">PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells.</a> Blood. , (2018).</li></ol>

היתרון של פרוטוקול זה הוא יצירת מודלים בעלי חיים מחסה מוטציות ספציפיות בתאי המטפאות באופן מהיר וחסכוני מאוד בהשוואה לגישות העכבר הקונבנציונלי הטרנסגניים. נמצא כי מתודולוגיה זו מאפשרת את הדור של עכברים עם תא המטפאות מניפולציות גנים בתוך חודש 1. בפרוטוקול זה קיימים מספר שלבים קריטיים המחי?...

מחקרים רבים ב המטולוגיה ואימונולוגיה להסתמך על הזמינות של עכברים מהונדסים גנטית, כולל עכברים קונבנציונאלי ומותנה/להקיש החוצה להשתמש בעכבר מערכת ספציפיים מנהלי המערכת כגון Mx1-היצור, ו-מונה, ואחרים . אחת,שתיים, שלוש,ארבע,חמש אסטרטגיות אלה דורשות הקמתה של זנים העכבר החדש, אשר יכול להיות זמן רב והורדה פיננסית. בעוד ההתקדמות המהפכנית בטכנולוגיית עריכת הגנום אפשרו את הדור של זנים העכבר החדש כמה ש3-4 חודשים עם המומחיות הטכנית המתאימה6,7,8,9 , הרבה יותר זמן נדרש כדי להגביר את מושבת העכבר לפני ניסויים רודפים. בנוסף, הליכים אלה יקרים. לדוגמה, מעבדת ג'קסון מפרטת את המחיר הנוכחי של שירותי הדור של עכברים שיצאו לשלב ב-$16,845 לכל מאמץ (כמו בדצמבר 2018). לכן, שיטות חסכוניות יותר ויעילות יותר מאשר גישות קונבנציונאלי מורגניים הינה יתרון רב יותר.
באשכולות באופן קבוע הכולל מרווח קצר הכולל/החלבון CRISPR המשויך החלבונים 9 (CRISPR/Cas9) הטכנולוגיה הובילה לפיתוח כלים חדשים עבור מהירה ויעילה RNA מבוססי, רצף ספציפי הגנום עריכה. התגלתה במקור כמנגנון החיסון בקטריאלי אדפטיבית להרוס את ה-DNA הפתוגן הפולש, crispr/Cas9 מערכת שימש ככלי כדי להגדיל את האפקטיביות של עריכת הגנום בתאים איקריוטית ודגמי בעלי חיים. מספר גישות המועסקים לשדר CRISPR/Cas9 מכונות לתאי גזע המטפאות (כלומר, אלקטרופורציה, נוקלאופיקציה, ליפופה, משלוח נגיפי, ועוד).
כאן, מערכת הנגיף מועסק כדי לשנות את התאים בשל יכולתה להדביק ביעילות Cas9-הבעת הפנים מורה בתאי גזע וחבילה יחד מדריך RNA ביטוי בונה, היזמים, רצפי רגולציה, וגנים לקודד חלבונים של כתב פלורסנט (כלומר, GFP, RFP). באמצעות שיטה זו, vivo gene לשעבר לעריכה של תאי גזע העכבר המטפאות הושג, ואחריו החוקה מוצלחת של מח עצם בעכברים לקרינה לעבר לבידוד10. וקטור לווירוס מועסק עבור מחקר זה מבטא את Cas9 ו GFP הכתב גנים מן היזם ליבה משותפת EF1a עם הכניסה הפנימי ריבוזומזיט במעלה מהגן העיתונאי. רצף ה-RNA המנחה מתבטא מיזם U6 נפרד. מערכת זו משמשת לאחר מכן כדי ליצור מוטציות הכניסה והמחיקה של המועמד השבטיים גנים מנהלי התקן Tet2 ו Dnmt3a10. עם זאת, יעילות התמרה באמצעות שיטה זו נמוכה יחסית (~ 5%-10%) בשל גודל גדול של הוספת וקטור (13 kbp) כי מגביל את היעילות התמרה ומפחית סיכוייו וירוס במהלך הייצור.
במחקרים אחרים, זה הוכח כי גודל גדול יותר של רנ א ויראלי שלילית משפיע על ייצור וירוס ויעילות התמרה. לדוגמה, גידול של 1 kb בגודל ההכנסה מדווח כדי להקטין את ייצור וירוסים על-ידי ~ 50%, ואת יעילות התמרה תפחית ליותר מ 50% בתאי גזע המטפאות11. לכן, זה יתרון כדי להקטין את הגודל של הכנס ויראלי ככל האפשר כדי לשפר את היעילות של המערכת.
הגרעון הזה יכול להתגבר על ידי שימוש בעכברים Cas9 טרנסגניים, שבו החלבון Cas9 מתבטא בצורה חוקתית או inducible בדרך12. העכברים כמובן/Cas9 טוק-in העכבר מבטא Cas9 endonuclease ו-EGFP מן היזם הקאג ב Rosa26 לוקוס באופן מקום. Thus, בונה עם sgRNA תחת השליטה של היזם U6 ו RFP גן העיתונאי תחת השליטה של היזם הליבה EF1a ניתן להעביר באמצעות וקטור הווירוס כדי להשיג את עריכת הגנום. בעזרת מערכת זו, הגנים של תאי גזע המטבטיים נערכו בהצלחה, מראה היעילות של ~ 90% התמרה. כך, פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואפקטיבית ליצור עכברים שבו מוטציות גנים ממוקדות מוצגים לתוך המערכת המטתית. בעוד המעבדה שלנו היא בעיקר באמצעות סוג זה של טכנולוגיה כדי ללמוד את התפקיד של המטופאות שבטיים בתהליכי מחלות לב וכלי דם13,14,15, זה חל גם על מחקרים של המטולוגית ממאירות16. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן להרחיב לניתוח של איך מוטציות DNA ב HSPC השפעה מחלות אחרות או תהליכים התפתחותיים במערכת המטפאות.
כדי להקים מערכת חזקה וקטורית וקטורי, סיכוייו גבוהה ויראלי מניות ותנאים אופטימיזציה עבור התמרה והשתלת תאים המטפאות נדרשים. בפרוטוקול, הוראות מסופקות על הכנת מניות סיכוייו גבוהה ויראלי בסעיף 1, אופטימיזציה של תנאי התרבות של תאי גזע המטפי מורטין בסעיף 2, שיטות השתלת מח עצם בסעיף 3, והערכה בתיאום מקטע 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:936px;" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td style="width:159px;">EXELINT</td>
			<td style="width:113px;">26028</td>
			<td style="width:150px;">general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216--</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560599</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552094</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365974</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 18 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 22 G&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:159px;">Biolegend</td>
			<td style="width:113px;">100752</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100349</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9007-34-5</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">CRISPR/Cas9 knock-in mice</td>
			<td style="width:159px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:113px;">028555</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>352054</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&#160;</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>353046</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand microhematocrit capillary tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:113px;">11-0042-85</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554655</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td>
			<td style="width:159px;">Clontech</td>
			<td style="width:113px;">632636</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X qRT-PCR Titration Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV004SL</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1152-82</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI MAX</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560602</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>57823</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMG2D</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polybrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>326823</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine TPO&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>315-14</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemSpan SFEM</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>09600</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:159px;">Thermo fisher Scientific</td>
			<td>K457501</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Solution&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models

מניפולציה גנים בתאי גזע המטבטיים באמצעות גישות הטרנסגנזה קונבנציונאלי יכול לגזול זמן רב, יקר, ומאתגר. נהנה מהתקדמות בטכנולוגיה לעריכת הגנום, מערכות משלוח וירוסים-מתווכת טרנסגנטית, שיטה יעילה וחסכונית מתוארת כאן כי קובע עכברים שבו הגנים מניפולציות במיוחד בתאי גזע המטפאות. השימוש בווירוסים משמשים כדי להפוך את Cas9-הביטוי השושלת-שלילי בתאי מח עצם עם מדריך RNA (gRNA) מיקוד גנים ספציפיים גן כתבת הקרינה האדומה (RFP), אז תאים אלה הם מושתלים לתוך לC57BL/6 עכברים. עכברים המושתלים עם הבעת וירוס לבטא gRNA לא המיקוד משמשים כפקדים. בתאום מראש של תאי גזע המטבטיים מוערכים על-ידי ניתוח ציטומטלי של דם היקפי של RFP-חיוביים. באמצעות שיטה זו, ~ 90% התמרה של תאים מיאלואיד ו ~ 70% של תאי הלימפה ב 4 שבועות לאחר ההשתלה ניתן להשיג. דנ א גנומית מבודדת מתאי דם RFP-חיוביים, וחלקים של ה-DNA באתר ממוקד מוגברת על ידי PCR כדי לאמת את עריכת הגנום. פרוטוקול זה מספק הערכה של תפוקה גבוהה של גנים המטפאות-רגולציה וניתן להרחיב למגוון מודלים של מחלת העכבר עם מעורבות תא המטפאות.

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, כ 0.8-1.0 x 108 תאים מח עצם לכל עכבר הושגו. מספר שושלת היוחסין-תאים שליליים שאנו משיגים הוא כ 3 x 106 תאים לכל עכבר. בדרך כלל, התשואה של שושלת מח העצם-תאים שליליים הוא 4%-5% מזה של תאים גרעיניים מח העצם הכולל.
?...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

פיתחנו שיטה יעילה וחסכונית להקמת עכברים עם מניפולציה בגנים במיוחד בתאי גזע hematopoietic, באמצעות טכנולוגיית עריכת גנום ומערכות העברת טרנסג'נדרים מתווכים lentivirus. היתרון של פרוטוקול זה הוא שאנחנו יכולים ליצור מודלים של בעלי חיים מחסה מוטציות ספציפיות בתאים hematopoietic בצורה מהירה וחסכונית בהשוואה לגישות מהודרות עכבר קונבנציונלי. הדגמת ההליך תהיה יינג וונג, חוקר מהמעבדה שלי.כדי ליצור חלקיקי lentivirus, להתחיל על ידי קידוד צלחת שש גם עם תווי קולגן דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות. לאחר מכן, זרע 293T תאים על הצלחת הדגירה אותו עוד שעתיים. בינתיים, להכין את התערובת של שלוש פלסמידים transfection על ידי שילוב של 0.9 מיקרוגרם של וקטור lentivirus, 0.6 מיקרוגרם של psPAX2 ו 0.3 מיקרוגרם של pMD2.G ו deionized ל 10 microliters לכל באר. לאחר מכן, מוסיפים בזהירות 50 מיקרוליטרים של 1X PBS וחמישה מיקרוליטרים של PEI MAX מדולל לתערובת הפלסמיד, ומדגרים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של DMEM.שאפו את התקשורת מצלחת ששת הטובים והוסיפו מיליליטר אחד של תערובת פלסמיד לכל באר. דגירה הצלחת לעוד שלוש שעות. החלף את המדיה ב- DMEM טרי ודגירה למשך 24 שעות.הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM טרי והתווספו 24 שעות נוספות. לאחר הדגירה הכוללת של 48 שעות, מעבירים את העל-טבעי לצינור של 50 מיליליטר ומעבירים אותו ב-3000 פעמים G למשך 15 דקות כדי להסיר תאים צפים חופשיים. סנן את העל-טבעי באמצעות מסנן מיקרומטר 0.45 ולחץ עליו צנטריפוגה למשך שלוש שעות.בזהירות שאף את העל-טבעי, והשאיר מאחור את גלולת הלבן. להשעות מחדש את גלולה עם 100 microliters של סרום חינם hematopoietic התא הרחבת מדיום ללא אוויר. שמור aliquot 10 microliter למדוד את טיטר ויראלי ולאחסן את שאר ההשעיה במינוס 80 צלזיוס עד מוכן לשימוש.לאחר בידוד העצמות, מניחים אותם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר עם RPMI ומניחים את הצינור על קרח. בארון ביו-בטיחות, העבר את העצמות לצלחת תרבות סטרילית של 100 מילימטר. ואז לתפוס עצם עם מדפים קהים, ולהשתמש מספריים ניתוח לחתוך בזהירות את שני האפיפיזיות.מלא מזרק 10 מיליליטר עם RPMI קר כקרח ולהשתמש מחט 22 מד לשטוף את מח העצם מהפיר לתוך צלחת תרבות חדשה 100 מילימטר. אחרי כל מח העצם נאסף, להפוך את ההשעיה תא יחיד על ידי העברת מח העצם דרך מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18 מד. לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.ואז צנטריפוגה הצינור על פי הוראות כתב היד ושואפים את העל-טבעי. השהה מחדש את כדורי התא באמצעי אחסון מתאים של מאגר הפרדה ממוטב. כדי לבודד תאים שליליים בשושלת, השתמש בערכת דלדול תאי שושלת בהתאם להוראות היצרן.להשעות מחדש את התאים השליליים שושלת מבודדת במדיום הרחבת תא hematopoietic ללא סרום. לפני הדגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני במשך שעתיים. לאחר מכן מוסיפים lentivirus על פי הוראות כתב היד ולהשאיר את התאים באינקובטור עוד 16 עד 20 שעות.למחרת, לאסוף את התאים lentivirus-מתמר בצינור חרוט 15 מיליליטר צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. על פי הנחיות NHA, חשוב לטפל וקטורים lentivirus בקבוצת ריס רמה שתיים. יש לנקוט באמצעי זהירות, בהתאם לתקנות המתקן.בזהירות שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור ב-200 מיקרוליטרים של RPMI לעכבר. שמור על התאים בטמפרטורת החדר עד להשתלה לעכברים. לאחר סשן ההקרנה השני, מזריקים רטרו-מסלולית תאים שליליים מתומרים לכל עכבר הרדמה באמצעות מזרק אינסולין.שלושה עד ארבעה שבועות לאחר השתלת מח עצם, להשיג דגימות דם מן וריד רטרו-מסלולית באמצעות צינורות נימי. מעבירים 20 מיקרוליטרים של דם למבחנות פוליסטירן עגולות וממקמים על קרח. לאחר תזה RBC, לה הדגירה את התאים עם קוקטייל של נוגדנים חד שבטיים בחושך במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, לשטוף, לתקן צנטריפוגה את התאים מחדש להשעות את גלולת התא ב 400 microliters של מאגר FACS. שמור את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. הצלחה של התפלת תאים שליליים שושלת ניתן להעריך עם זיהוי ציטומטרי זרימה של RFP.הוכח כי לאחר שבעה ימים של תרבות במבחנה, בממוצע, 75.7% מהתאים מתומרים. ציטומטריית זרימה שימשה גם לניתוח דם היקפי של העכבר לאחר ארגון מחדש עם תאי גזע המטופויטיים מתומרים ולא מתומרים. ממוצע של 94.8% של נויטרופילים, 93.5% של מונוציטים, ו 82.7% של תאים B להביע RFP.דנ"א גנומי מתאים חיוביים RFP כבר PCR מוגברת ותת משובטה לניתוח רצף. מוטציות שונות מזוהות ו-69% מהשכפולים מראים מוטציות מחוץ למסגרת או עצירה מוקדמת. כדי להצליח עם הליך זה, הכנת מלאי אנטי וירוס גבוה ותנאים אופטימיזציה עבור התפלה והשתלה של תאים hematopoietic נדרשים.יישמו טכניקה זו כדי ללמוד את החוק של מחלת לב וכלי דם. אבל זה גם שימושי ללמוד ממאירות המטולוגית. שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את הפונקציות של סוגים חדשים של גנים במערכת hematopoietic בצורה יעילה וגבוהה.אנחנו אוספים את זה על הזמינות של עכברים מהו מהודרים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...