Name: lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

एस एस एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन postdoctoral फैलोशिप 17POST33670076 द्वारा समर्थित किया गया था. के डब्ल्यू NIH अनुदान R01 HL138014, R01 HL141256, और R01 HL139819 द्वारा समर्थित किया गया था.

पशु विषयों से संबंधित सभी प्रक्रियाओं को वर्जीनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. lentivirus कणों की पीढ़ी और शुद्धि
नोट: अनुकूल?...

<ol>
	<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells.">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li><li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+vav,+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment.">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li><li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid,+Spontaneous,+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia.">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia.">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL/6+Cas9+transgenic+mouse+line.">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta/NLRP3+Inflammasome.">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease.">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation.">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875 (2015).</li><li>Cribbs, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li><li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements.">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li><li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis:+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease.">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li><li>Kahn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPM1D+truncating+mutations+confer+resistance+to+chemotherapy+and+sensitivity+to+PPM1D+inhibition+in+hematopoietic+cells.">PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells.</a> Blood. , (2018).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल का लाभ पारंपरिक माउस ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में एक तेजी से और अत्यधिक लागत प्रभावी तरीके से hematopoietic कोशिकाओं में विशिष्ट उत्परिवर्तनों शरण पशु मॉडल का निर्माण है. यह पाया गया कि इस ?...

हेमेटोपोईटिक सिस्टम-विशिष्ट क्रे ड्राइवरों जैसे Mx1-Cre, Vav-Cre, और अन्य का उपयोग करने वाले पारंपरिक और सशर्त ट्रांसजेनिक/नॉक-आउट चूहों सहित आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की उपलब्धता पर कई अध्ययन निर्भर करते हैं। 1,2,3,4,5. इन रणनीतियों के लिए नए माउस उपभेदों की स्थापना की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली और आर्थिक रूप से बोझ हो सकती है। जबकि जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में क्रांतिकारी प्रगति ने उपयुक्त तकनीकी विशेषज्ञता6,7,8,9 के साथ कम से कम 3-4 महीनों में नए माउस उपभेदों की पीढ़ी को सक्षम किया है , प्रयोगों का अनुसरण करने से पहले माउस कॉलोनी को बढ़ाना अधिक समय की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इन प्रक्रियाओं महंगा कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, जैक्सन प्रयोगशाला दस्तक बाहर चूहों पीढ़ी सेवाओं की वर्तमान कीमत की सूची में $ 16,845 प्रति तनाव (दिसंबर 2018 के रूप में). इस प्रकार, तरीकों कि पारंपरिक murine ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में अधिक किफायती और कुशल हैं और अधिक लाभप्रद हैं.
क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल वाले लघु पैलिड्रोमिक दोहराता/CRISPR संबद्ध प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रौद्योगिकी ने तीव्र और कुशल आरएनए-आधारित, अनुक्रम-विशिष्ट जीनोम संपादन के लिए नए उपकरणों का विकास किया है। मूल रूप से हमलावर रोगज़नक़ डीएनए को नष्ट करने के लिए एक जीवाणु अनुकूली प्रतिरक्षा तंत्र के रूप में की खोज की, CRISPR/Cas9 प्रणाली एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है यूकैरियोटिक कोशिकाओं और पशु मॉडल में जीनोम संपादन की प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए. CRISPR/Cas9 मशीनरी को हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (यानी, इलेक्ट्रोपोरिओशन, नाभिक, लिपोफेक्शन, वायरल डिलीवरी, और अन्य) में संचारित करने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया गया है।
यहाँ, एक lentivirus प्रणाली को प्रभावी ढंग से Cas9-expressing murine hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को संक्रमित करने की क्षमता के कारण कोशिकाओं ट्रांसड्यूस करने के लिए कार्यरत है और एक साथ गाइड आरएनए अभिव्यक्ति का निर्माण पैकेज, प्रमोटरों, नियामक दृश्यों, और जीन है कि एन्कोकोड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन (यानी, GFP, आरएफपी). इस विधि का उपयोग करते हुए, माउस हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के पूर्व विवो जीन संपादन हासिल किया गया है, घातक विकिरणित चूहों में अस्थि मज्जा के सफल पुनर्गठन के बाद10. इस अध्ययन के लिए कार्यरत lenivirus वेक्टर एक आंतरिक राइबोसोमल प्रवेश साइट रिपोर्टर जीन से ऊपर के साथ आम कोर EF1a प्रमोटर से Cas9 और GFP रिपोर्टर जीन व्यक्त करता है. गाइड आरएनए अनुक्रम एक अलग U6 प्रमोटर से व्यक्त की है. इस प्रणाली तो उम्मीदवार क्लोनल hematopois ड्राइवर जीन Tet2 और Dnmt3a10में प्रविष्टि और विलोपन उत्परिवर्तन बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है . हालांकि, इस विधि द्वारा transduction दक्षता अपेक्षाकृत कम है ($5%-10%) वेक्टर डालने के बड़े आकार के कारण (13 Kbp) कि transduction दक्षता सीमा और उत्पादन के दौरान वायरस titer कम कर देता है.
अन्य अध्ययनों में, यह दिखाया गया है कि बड़ा वायरल आरएनए आकार नकारात्मक दोनों वायरस उत्पादन और transduction दक्षता को प्रभावित करता है. उदाहरण के लिए, सम्मिलित आकार में 1 केबी वृद्धि से वायरस के उत्पादन में $50% की कमी आई है, और ट्रांसडक्शन दक्षता माउस हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल11में 50% से अधिक तक कम हो जाएगी। इस प्रकार, यह प्रणाली की दक्षता में सुधार करने के लिए संभव के रूप में ज्यादा वायरल डालने के आकार को कम करने के लिए फायदेमंद है।
इस कमी को Cas9 ट्रांसजेनिक चूहों को रोजगार देकर दूर किया जा सकता है, जिसमें Cas9 प्रोटीन या तो एक संरचक या प्रेरक तरीके से व्यक्त किया जाता है12. गठन CRISPR/Cas9 दस्तक में चूहों एक सर्वव्यापी तरीके से Rosa26 स्थानों पर कैग प्रमोटर से Cas9 endonuclease और EGFP व्यक्त करता है. इस प्रकार, कोर EF1a प्रमोटर के नियंत्रण में U6 प्रमोटर और आरएफपी रिपोर्टर जीन के नियंत्रण में sgRNA के साथ एक निर्माण जीनोम संपादन प्राप्त करने के लिए lentivirus वेक्टर का उपयोग कर वितरित किया जा सकता है. इस प्रणाली के साथ, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के जीन सफलतापूर्वक संपादित किया गया है, एक $90% transduction दक्षता दिखा. इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल चूहों को बनाने के लिए एक त्वरित और प्रभावी तरीका प्रदान करता है जिसमें लक्षित जीन उत्परिवर्तनों को हेमेटोपोएटिक प्रणाली में पेश किया जाता है। जबकि हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से हृदय रोग प्रक्रियाओं में क्लोनहेमितोपोसिस की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस प्रकार की प्रौद्योगिकी का उपयोग कर रही है13,14,15, यह भी रुमटोलॉजिकल के अध्ययन के लिए लागू होता है द्रोह16| इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल कैसे HSPC में डीएनए उत्परिवर्तन ों hematopoietic प्रणाली में अन्य रोग या विकासात्मक प्रक्रियाओं को प्रभावित के विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है.
एक मजबूत मसूरी वायरस वेक्टर सिस्टम स्थापित करने के लिए, उच्च टिटर वायरल स्टॉक और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के ट्रांसडक्शन और प्रत्यारोपण के लिए अनुकूलित शर्तों की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल में, अनुभाग 1 में एक उच्च टिटर वायरल स्टॉक की तैयारी पर निर्देश दिए गए हैं, खंड 2 में murine hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन, खंड 3 में अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए तरीके, और आकलन अनुभाग 4 में engraftment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:936px;" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td style="width:159px;">EXELINT</td>
			<td style="width:113px;">26028</td>
			<td style="width:150px;">general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216--</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560599</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552094</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365974</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 18 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 22 G&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:159px;">Biolegend</td>
			<td style="width:113px;">100752</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100349</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9007-34-5</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">CRISPR/Cas9 knock-in mice</td>
			<td style="width:159px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:113px;">028555</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>352054</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&#160;</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>353046</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand microhematocrit capillary tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:113px;">11-0042-85</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554655</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td>
			<td style="width:159px;">Clontech</td>
			<td style="width:113px;">632636</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X qRT-PCR Titration Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV004SL</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1152-82</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI MAX</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560602</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>57823</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMG2D</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polybrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>326823</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine TPO&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>315-14</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemSpan SFEM</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>09600</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:159px;">Thermo fisher Scientific</td>
			<td>K457501</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Solution&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models

पारंपरिक ट्रांसजेनेसिस दृष्टिकोण का उपयोग कर hematopoietic स्टेम कोशिकाओं में जीन हेरफेर समय लेने वाली, महंगा, और चुनौतीपूर्ण हो सकता है. जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी और lentivirus मध्यस्थता transgene वितरण प्रणाली में अग्रिमों से लाभ, एक कुशल और किफायती विधि यहाँ वर्णित है कि चूहों जिसमें जीन hematopoietic स्टेम कोशिकाओं में विशेष रूप से हेरफेर कर रहे हैं स्थापित करता है. Lentiviruses एक गाइड आरएनए (GRNA) विशिष्ट जीन और एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन (RFP) को लक्षित के साथ Cas9-expressing वंश-नकारात्मक अस्थि मज्जा कोशिकाओं ट्रांसड्यूस करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो इन कोशिकाओं घातक विकिरणC57BL/6 चूहों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं। गैर-लक्ष्यीकृत GRNA व्यक्त lentivirus के साथ प्रत्यारोपित चूहे नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. ट्रांसड्यूस्ड हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के engraftment परिधीय रक्त के आरएफपी सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। इस विधि का उपयोग करना, $90% माइलॉयड कोशिकाओं के transduction और प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह में लसीकाभ कोशिकाओं के 70% प्राप्त किया जा सकता है. जीनोमिक डीएनए आरएफपी-सकारात्मक रक्त कोशिकाओं से अलग है, और लक्षित साइट डीएनए के कुछ हिस्सों को पीसीआर द्वारा जीनोम संपादन को मान्य करने के लिए बढ़ाया जाता है। इस प्रोटोकॉल hematopoiesis-नियामक जीन के एक उच्च throughput मूल्यांकन प्रदान करता है और hematopoietic सेल भागीदारी के साथ माउस रोग मॉडल की एक किस्म के लिए बढ़ाया जा सकता है.

उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करना, लगभग 0.8-1.0 x 108 अस्थि मज्जा कोशिकाओं प्रति माउस प्राप्त किया गया है. हमारे द्वारा प्राप्त वंश-ऋणात्मक कोशिकाओं की संख्या लगभग 3 x 106 कोशिकाओं प्रति माउस ह...

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Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

CRISPR/Cas9 प्रणाली द्वारा यूरीन हेमेटोपोएटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) के अत्यधिक कुशल जीनोम संपादन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ताकि हेमटोपोएटिक सिस्टम-विशिष्ट जीन संशोधनों के साथ माउस मॉडल सिस्टम को तेजी से विकसित किया जा सके।

Lentiviral CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन रोग मॉडल में Hematopoietic कोशिकाओं के अध्ययन के लिए

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

हमने विशेष रूप से हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं में जीन हेरफेर के साथ चूहों को स्थापित करने के लिए एक कुशल और किफायती विधि विकसित की है, जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी और लेंटीवायरस-मध्यस्थता ट्रांसजीन डिलीवरी सिस्टम का उपयोग करके। इस प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि हम पारंपरिक माउस ट्रांसजेनिक दृष्टिकोणों की तुलना में तेजी से और लागत प्रभावी तरीके से हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं में विशिष्ट उत्परिवर्तनों को शरण देने वाले पशु मॉडल बना सकते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला से एक शोधकर्ता, Ying वांग होगा ।लेंटीवायरस कणों को उत्पन्न करने के लिए, कोलेजन समाधान के साथ एक छह अच्छी तरह से प्लेट कोडिंग और इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेटिंग करके शुरू करें। फिर, बीज 293T कोशिकाओं को थाली पर और यह एक और दो घंटे के लिए इनक्यूबेट । इस बीच, 0.9 माइक्रोग्राम लेंटीवायरस वेक्टर, 0.6 माइक्रोग्राम psPAX2 और 0.3 माइक्रोग्राम पीएमडी2 के संयोजन से तीन ट्रांसफैक्शन प्लाज्मिड्स का मिश्रण तैयार करें।जी और प्रति अच्छी तरह से 10 माइक्रोलीटर के लिए deionized । फिर, ध्यान से प्लाज्मिड मिश्रण में 1X पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर और पतला पीई मैक्स के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण को कमरे के तापमान पर 15 मिनट तक इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, डीएमईएम का एक मिलीलीटर जोड़ें।छह अच्छी तरह से थाली से मीडिया आकांक्षी और प्रत्येक अच्छी तरह से प्लाज्मिड मिश्रण के एक मिलीलीटर जोड़ें । एक और तीन घंटे के लिए थाली इनक्यूबेट । मीडिया को ताजा डीएमईएम से बदलें और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।ताजा DMEM के एक मिलीलीटर जोड़ें और एक अतिरिक्त 24 घंटे इनक्यूबेट । कुल 48 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, सुपरनेट को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और किसी भी मुक्त-फ्लोटिंग कोशिकाओं को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए इसे 3000 बार जी पर अपकेंद्री करें। सुपरनेट को 0.45 माइक्रोमीटर फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और इसे तीन घंटे तक अल्ट्रा-सेंट्रलाइज करें।सफेद गोली को पीछे छोड़ते हुए, सुपरनेट को ध्यान से एस्पिरेट करें। बिना वार्नेशन के सीरम-मुक्त हेमेटोपोइटिक सेल विस्तार माध्यम के 100 माइक्रोलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। वायरल टाइटर को मापने के लिए 10 माइक्रोलीटर एलिकोट रखें और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक शेष निलंबन को शून्य से 80 सेल्सियस पर स्टोर करें।हड्डियों को अलग-थलग करने के बाद उन्हें आरपीएमआई के साथ 50 मिलीलीटर शंकु नली में रखें और ट्यूब को बर्फ पर रखें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, हड्डियों को बाँझ 100 मिलीमीटर संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें। फिर कुंद संदंश के साथ एक हड्डी को समझें, और दोनों एपिफिसिस को ध्यान से काटने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।बर्फ ठंड RPMI के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और एक नया १०० मिलीमीटर संस्कृति पकवान में शाफ्ट से अस्थि मज्जा फ्लश करने के लिए एक 22 गेज सुई का उपयोग करें । सभी अस्थि मज्जा एकत्र किया गया है के बाद, एक 18 गेज सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से अस्थि मज्जा पारित करके एक एकल सेल निलंबन करें । 50 मिलीलीटर शंकु नली में 70 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।फिर पांडुलिपि के निर्देशों के अनुसार ट्यूब को अपकाइज करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें। अनुकूलित पृथक्करण बफर की उचित मात्रा में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। वंश नकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वंश सेल कमी किट का उपयोग करें।सीरम मुक्त हेमेटोपोइटिक सेल विस्तार माध्यम में अलग-थलग वंश नकारात्मक कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। दो घंटे तक 5% कार्बन डाइऑक्साइड में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-इनक्यूबेट किया। फिर पांडुलिपि के निर्देशों के अनुसार लेंटीवायरस जोड़ें और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में एक और 16 से 20 घंटे के लिए छोड़ दें।अगले दिन, लेंटीवायरस-ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु नली में इकट्ठा करें और उन्हें 10 मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। एनएचए दिशानिर्देशों के अनुसार, रीस ग्रुप स्तर दो पर लेंटीवायरस वैक्टर को संभालना महत्वपूर्ण है। सुविधा विनियमों के आधार पर सावधानियां बरती जानी चाहिए ।ध्यान से सुपरनेट को एस्पिरेट करें और प्रति माउस आरपीएमआई के 200 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। चूहों में प्रत्यारोपण तक कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को रखें। दूसरे विकिरण सत्र के बाद, रेट्रो-ऑर्बिटली इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके प्रत्येक एनेस्थेटाइज्ड माउस में ट्रांसड्यूडेड डेलाइनेज नकारात्मक कोशिकाओं को इंजेक्ट करें।बोन मैरो प्रत्यारोपण के तीन से चार सप्ताह बाद, केशिका ट्यूबों का उपयोग करके रेट्रो-कक्षीय नस से रक्त के नमूने प्राप्त करें। रक्त के 20 माइक्रोलीटर को राउंड-बॉटम पॉलीस्टीरिन टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें। आरबीसी लाइसिस के बाद, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के कॉकटेल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद कोशिकाओं को धोएं, ठीक करें और सेंट्रलाइज करें और FACS बफर के 400 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से सस्पेंड करें। नमूनों को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण तक चार डिग्री सेल्सियस पर रखें। वंश नकारात्मक कोशिका स्थानांतरण की सफलता का मूल्यांकन आरएफपी के प्रवाह साइटोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ किया जा सकता है।यह दर्शाया गया है कि इन विट्रो संस्कृति के सात दिनों के बाद, औसतन, 75.7% कोशिकाओं को स्थानांतरित किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग ट्रांसड्यूडेड और गैर-ट्रांसड्यूडेड हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन के बाद माउस पेरिफेरल रक्त का विश्लेषण करने के लिए भी किया गया है। न्यूट्रोफिल का औसत 94.8%, मोनोसाइट्स का 93.5%और बी सेल का 82.7%आरएफपी व्यक्त करता है।आरएफपी-पॉजिटिव ब्लड सेल्स से जीनोमिक डीएनए को पीसीआर परिलक्षित और अनुक्रम विश्लेषण के लिए उप-क्लोन किया गया है । विभिन्न म्यूटेशन का पता लगाया जाता है और 69% क्लोन फ्रेम या समय से पहले स्टॉप म्यूटेशन से बाहर दिखाई देते हैं। इस प्रक्रिया के साथ सफल होने के लिए, उच्च एंटीवायरस स्टॉक की तैयारी और हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के लेनदेन और प्रत्यारोपण के लिए अनुकूलित शर्तों की आवश्यकता होती है।हमने कार्डियो वैस्कुलर डिजीज के कानून का अध्ययन करने के लिए यह तकनीक लागू की है। लेकिन हेमेटोलॉजिकल द्रोह का अध्ययन करना भी उपयोगी है। यह विधि हमें उच्च कुशल और उच्च तरीके से हेमेटोपोइटिक प्रणाली में नए प्रकार के जीन के कार्यों का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है।हम ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता पर यह इकट्ठा करते हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

होस्ट में शामिल कारक के लिए आरएनएआई स्क्रीनिंग चेचक वायरस संक्रमण का उपयोग ड्रोसोफिला कक्ष

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

कालोनी मानव hematopoietic कोशिकाओं के लिए सेल के गठन परख (सीएफसी)

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

एचआईवी -1 सकारात्मक कक्ष का उपयोग एक रेव निर्भर lentiviral वेक्टर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की विशिष्ट चिह्नित

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Seven Steps to Stellate Cells

सात कदम कक्ष तारामय

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

एक<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; सह - संक्रमण का अध्ययन करने के लिए मॉडल<em&gt; प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emमानव प्राथमिक monocyte व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं में&gt; एचआईवी -1 सहभागिता

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Polarized मानव airway के एक तरल से ढके संस्कृति की स्थापना उपकला Calu 3 मेजबान सेल श्वसन रोगज़नक़ों रिस्पांस कोशिकाओं के अध्ययन<em&gt; इन विट्रो में</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Hematopoietic progenitors के दत्तक हस्तांतरण का उपयोग कर Peyer पैच में murine plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं के विकास का आकलन

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Chimeric माउस मॉडल में संयोजक फ्लू के टीके की intranasal प्रशासन mucosal प्रतिरक्षण अध्ययन करने के लिए

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

की इंट्रा-सांस की नली प्रशासन<em&gt; हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा</em&gt; माउस मॉडल में अध्ययन करने के लिए airway सूजन

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

विधियों का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रोफिल में लिपिड बदलाव और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल के बाद के गठन

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...