Name: lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

S. S. è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association 17POST33670076. K. W. era supportato dalle sovvenzioni NIH R01 HL138014, R01 HL141256 e R01 HL139819.

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della Virginia.
1. Generazione e purificazione delle particelle di lentivirus
NOTA: Le particelle di Lentivirus contenenti la guida ottimizzata RNA possono essere prodotte dai protocolli dettagliati forniti da Addgene: <https://media.addgene.org/cms/files/'hang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf)>. I metodi ot...

<ol>
	<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells.">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li><li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+vav,+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment.">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li><li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid,+Spontaneous,+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia.">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia.">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease.">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li><li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells:+size+matters.">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li><li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL/6+Cas9+transgenic+mouse+line.">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta/NLRP3+Inflammasome.">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease.">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation.">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875 (2015).</li><li>Cribbs, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations.">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li><li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements.">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li><li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis:+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease.">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li><li>Kahn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPM1D+truncating+mutations+confer+resistance+to+chemotherapy+and+sensitivity+to+PPM1D+inhibition+in+hematopoietic+cells.">PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells.</a> Blood. , (2018).</li></ol>

Il vantaggio di questo protocollo è la creazione di modelli animali che ospitano mutazioni specifiche nelle cellule ematopoietiche in modo rapido e altamente economico rispetto agli approcci transgenici murini convenzionali. Si è scoperto che questa metodologia consente la generazione di topi con manipolazioni geniche delle cellule ematopoietiche entro 1 mese. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che richiedono ulteriore considerazione.
Screening della sequenza di gR...

Molti studi in ematologia e immunologia si basano sulla disponibilità di topi geneticamente modificati, tra cui topi transgenici/knock-out convenzionali e condizionali che utilizzano driver Cre specifici del sistema ematopoietico come Mx1-Cre, Vav-Cre e altri 1,2,3,4,5. Queste strategie richiedono la creazione di nuovi ceppi di topi, che possono richiedere molto tempo e gravare finanziariamente. Mentre i progressi rivoluzionari nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso la generazione di nuovi ceppi di topi in appena 3-4 mesi con l'adeguata competenza tecnica6,7,8,9 , è necessario molto più tempo per amplificare la colonia di topi prima di condurre esperimenti. Inoltre, queste procedure sono costose. Ad esempio, Jackson Laboratory elenca il prezzo attuale dei servizi di generazione di topi knock-out a 16.845 dollari per ceppo (a partire da dicembre 2018). Pertanto, i metodi più economici ed efficienti rispetto agli approcci transgenici murini convenzionali sono più vantaggiosi.
La tecnologia CRISPR/Cas9, regolarmente interspaziata, ripete a breve ad occhiindromici/proteina CRISPR associata a ROF (CRISPR/Cas9) ha portato allo sviluppo di nuovi strumenti per un rapido ed efficiente editing del genoma basato su RNA e sequenza. Originariamente scoperto come meccanismo immunitario adattativo batterico per distruggere il DNA patogeno invasore, il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato come strumento per aumentare l'efficacia dell'editing del genoma nelle cellule eucariotiche e nei modelli animali. Sono stati adottati diversi approcci per trasmettere macchinari CRISPR/Cas9 in cellule staminali ematopoietiche (ad esempio, elettroporazione, nucleofezione, lipofezione, esodo virale e altri).
Qui, un sistema di lentivirus viene impiegato per traducire le cellule grazie alla sua capacità di infettare efficacemente le cellule staminali murine ematopoietiche di Cas9 e di confezionare insieme il costrutto guida per l'espressione dell'RNA, i promotori, le sequenze regolatorie e i geni che codificano proteine reporter fluorescenti (ad esempio, GFP, RFP). Utilizzando questo metodo, è stata ottenuta l'editing genico ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche del topo, seguita da una ricostituzione di successo del midollo osseo in topi letali irradiati10. Il vettore lentivirus impiegato per questo studio esprime i geni dei reporter Cas9 e GFP del comune promotore di EF1a con un sito di ingresso ribosomico interno a monte del gene del reporter. La sequenza di RNA guida è espressa da un promotore U6 separato. Questo sistema viene quindi utilizzato per creare mutazioni di inserimento e delezione nei geni del driver di ematopoiesi clonale candidati Tet2 e Dnmt3a10. Tuttavia, l'efficienza della trasduzione con questo metodo è relativamente bassa (-5%-10%) a causa delle grandi dimensioni dell'inserto vettoriale (13 Kbp) che limita l'efficienza della trasduzione e riduce il titro del virus durante la produzione.
In altri studi, è stato dimostrato che la dimensione più grande dell'RNA virale influisce negativamente sia sulla produzione di virus che sull'efficienza della trasduzione. Ad esempio, un aumento di 1 kb nella dimensione dell'inserto è segnalato per ridurre la produzione di virus del 50%, e l'efficienza della trasduzione diminuirà a più del 50% nelle cellule staminali ematopoietiche del topo11. Pertanto, è vantaggioso ridurre il più possibile le dimensioni dell'inserto virale per migliorare l'efficienza del sistema.
Questa lacuna può essere superata impiegando topi transgenici Cas9, in cui la proteina Cas9 è espressa in modo flessibile o inducibile12. I topi knock-in CRISPR/Cas9 di tipo constitutivo escludano Cas9 endonuclease ed EGFP dal promotore CAG presso il locus Rosa26 in modo onnipresente. Così, un costrutto con sgRNA sotto il controllo del promotore U6 e del gene reporter RFP sotto il controllo del promotore core EF1a può essere consegnato utilizzando il vettore lentivirus per ottenere l'editing del genoma. Con questo sistema, i geni delle cellule staminali ematopoietiche sono stati modificati con successo, mostrando un'efficienza di trasduzione del 90%. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo rapido ed efficace per creare topi in cui nel sistema ematopoietico mirate vengono introdotte mutazioni genetiche mirate. Mentre il nostro laboratorio utilizza prevalentemente questo tipo di tecnologia per studiare il ruolo dell'ematopoiesi clonale nei processi di malattia cardiovascolare13,14,15, è applicabile anche agli studi di ematologica malignità16. Inoltre, questo protocollo può essere esteso all'analisi di come le mutazioni del DNA nell'HSPC influiscono su altri processi di malattia o di sviluppo nel sistema ematopoietico.
Per stabilire un robusto sistema vettoriale di lentivirus, sono necessari elevati titoli virali di titro e condizioni ottimizzate per la trasduzione e il trapianto di cellule ematopoietiche. Nel protocollo vengono fornite istruzioni sulla preparazione di uno stock virale ad alto titolo titer nella sezione 1, ottimizzando le condizioni di coltura delle cellule staminali ematopoietiche murine nel paragrafo 2, i metodi per il trapianto di midollo osseo nella sezione 3 e la valutazione l'innesto nella sezione 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:936px;" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td style="width:159px;">EXELINT</td>
			<td style="width:113px;">26028</td>
			<td style="width:150px;">general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216--</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560599</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552094</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365974</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 18 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 22 G&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:159px;">Biolegend</td>
			<td style="width:113px;">100752</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100349</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9007-34-5</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">CRISPR/Cas9 knock-in mice</td>
			<td style="width:159px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:113px;">028555</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>352054</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&#160;</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>353046</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand microhematocrit capillary tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:113px;">11-0042-85</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554655</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td>
			<td style="width:159px;">Clontech</td>
			<td style="width:113px;">632636</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X qRT-PCR Titration Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV004SL</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1152-82</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI MAX</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560602</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>57823</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMG2D</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polybrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>326823</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine TPO&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>315-14</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemSpan SFEM</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>09600</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:159px;">Thermo fisher Scientific</td>
			<td>K457501</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Solution&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models

La manipolazione dei geni nelle cellule staminali ematopoietiche utilizzando approcci convenzionali di transgenesi può essere dispendiosa in termini di tempo, costi e impegnativi. Approfittando dei progressi nella tecnologia di editing del genoma e nei sistemi di erogazione transgenici mediati da lentivirus, è descritto un metodo efficiente ed economico che stabilisce topi in cui i geni vengono manipolati specificamente nelle cellule staminali ematopoietiche. I lentivirus vengono utilizzati per trasdurre le cellule del midollo osseo con un'RNA guida (gRNA) mirato a geni specifici e a un gene di segnalazione della fluorescenza rossa (RFP), quindi queste cellule vengono trapiantate in topi C57BL/6 irradiati letale. I topi trapiantati con lentivirus che esprimono gRNA non mirati vengono utilizzati come controlli. L'innesto di cellule staminali ematopoietiche trasdotte viene valutato mediante analisi citometrica del flusso di leucociti RFP positivi al sangue periferico. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere la trasduzione di cellule mieloidi e il 70% delle cellule linfoidi a 4 settimane dopo il trapianto. Il DNA genomico è isolato dalle cellule del sangue RFP-positive e parti del DNA del sito mirato sono amplificate dalla PCR per convalidare l'editing del genoma. Questo protocollo fornisce una valutazione ad alto throughput dei geni regolatori dell'ematopoiesi e può essere esteso a una varietà di modelli di malattia dei topi con coinvolgimento delle cellule ematopoietiche.

Utilizzando il protocollo sopra descritto, sono stati ottenuti circa 0,8-1,0 x 108 cellule del midollo osseo per topo. Il numero di cellule lignaggio-negativo che otteniamo è di circa 3 x 106 celle per mouse. Tipicamente, la resa delle cellule del lingaggio-negativo del midollo osseo è del 4%-5% di quella delle cellule nucleari totali del midollo osseo.
Il chimerismo delle cellule trasdotte (RFP-positivo)...

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Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Abbiamo sviluppato un metodo efficiente ed economico per stabilire topi con manipolazione genica in particolare nelle cellule staminali ematopoietiche, utilizzando la tecnologia di editing del genoma e i sistemi di somministrazione transgene mediati dal lentivirus. Il vantaggio di questo protocollo è che possiamo creare modelli animali che ospitano mutazioni specifiche nelle cellule ematopoietiche in modo rapido ed economico rispetto agli approcci transgenici convenzionali del topo. A dimostrare la procedura sarà Ying Wang, un ricercatore del mio laboratorio.Per generare particelle di lentivirus, inizia codificando una piastra di sei pozza con soluzione di collagene e incubandola a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi, seminare cellule 293T sul piatto e incubarlo per altre due ore. Nel frattempo, preparare la miscela di tre plasmidi di trasfezione combinando 0,9 microgrammi di vettore di lentivirus, 0,6 microgrammi di psPAX2 e 0,3 microgrammi di pMD2.G e deionizzato a 10 microlitri per pozzo. Quindi, aggiungere con cura 50 microlitri di 1X PBS e cinque microlitri di PEI MAX diluito alla miscela plasmide e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di DMEM.Aspirare il supporto dalla piastra dei sei pozzetti e aggiungere un millilitro di miscela plasmide ad ogni pozzo. Incubare il piatto per altre tre ore. Sostituire il supporto con DMEM fresco e incubare per 24 ore.Aggiungere un millilitro di DMEM fresco e incubare altre 24 ore. Dopo un'incubazione totale di 48 ore, trasferire il supernatante in un tubo da 50 millilitri e centrifugarlo a 3000 volte G per 15 minuti per rimuovere eventuali cellule galleggianti. Filtrare il supernatante attraverso un filtro da 0,45 micrometri e ultra-centrifugarlo per tre ore.Aspirare con cura il supernatante, lasciandosi alle spalle il pellet bianco. Sospendere di nuovo il pellet con 100 microlitri di mezzo di espansione cellulare ematopoietico privo di siero senza aerazione. Mantenere un'aliquota di 10 microliter per misurare il ttarettare virale e conservare il resto della sospensione a meno 80 Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.Dopo aver isolato le ossa, posizionarle in un tubo conico da 50 millilitri con RPMI e posizionare il tubo sul ghiaccio. In un armadietto di biosicurezza, trasferire le ossa in un piatto sterile da coltura da 100 millimetri. Quindi afferrare un osso con le forcetrici smussate e utilizzare le forbici di dissezione per tagliare con cura entrambe le epifisi.Riempire una siringa da 10 millilitri con RPMI ghiacciato e utilizzare un ago calibro 22 per sciacquare il midollo osseo dall'albero in un nuovo piatto da coltura da 100 millimetri. Dopo che tutto il midollo osseo è stato raccolto, effettuare una sospensione a singola cella passando il midollo osseo attraverso una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 18. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a celle da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.Quindi centrifuga il tubo secondo le indicazioni del manoscritto e aspira il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet di cella in un volume appropriato di tampone di separazione ottimizzato. Per isolare le cellule negative del lignaggio, utilizzare un kit di esaurimento delle celle di lignaggio secondo le istruzioni del produttore.Sospendere di nuovo le cellule negative isolate del lignaggio nel mezzo di espansione delle cellule ematopoietiche privo di siero. Pre-incubare le cellule a 37 gradi celsius in anidride carbonica al 5% per due ore. Quindi aggiungere il lentivirus secondo le indicazioni del manoscritto e lasciare le cellule nell'incubatrice per altre 16-20 ore.Il giorno dopo, raccogliere le cellule trasdutite dal lentivirus in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugarle a 300 volte G per 10 minuti. Secondo le linee guida NHA, è importante gestire i vettori del lentivirus al livello due del Gruppo Reece. Devono essere prese precauzioni, in base alle norme sulle strutture.Aspirare con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 200 microlitri di RPMI per mouse. Mantenere le cellule a temperatura ambiente fino al trapianto nei topi. Dopo la seconda sessione di irradiazione, iniettare retro-orbitalmente cellule negative delineate in ogni topo anestetizzato utilizzando una siringa per insulina.Da tre a quattro settimane dopo il trapianto di midollo osseo, ottenere campioni di sangue dalla vena retro-orbitale usando tubi capillari. Trasferire 20 microlitri di sangue in provette di polistirolo a fondo rotondo e posizionarli sul ghiaccio. Dopo la lisi RBC, incubare le cellule con un cocktail di anticorpi monoclonali al buio per 20 minuti a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, lavare, fissare e centrifugare le cellule e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 400 microlitri di tampone FACS. Mantenere i campioni a quattro gradi Celsius fino all'analisi per citometria del flusso. Il successo della trasduzione di cellule negative del lignaggio può essere valutato con il rilevamento citometrico del flusso della RFP.È stato dimostrato che dopo sette giorni di coltura in vitro, in media, il 75,7 per cento delle cellule viene trasdotto. La citometria a flusso è stata anche utilizzata per analizzare il sangue periferico del topo dopo la ricostituzione con cellule staminali ematopoietiche trasdotto e non trasdotto. Una media del 94,8% dei neutrofili, del 93,5% dei monociti e dell'82,7% delle cellule B esprime RFP.Il DNA genomico delle cellule del sangue positive alla RFP è stato amplificato e sotto-clonato per l'analisi delle sequenze. Vengono rilevate varie mutazioni e il 69% dei cloni mostra mutazioni frame o premature stop. Per avere successo con questa procedura, è necessaria la preparazione di un elevato stock antivirus e condizioni ottimizzate per la trasduzione e il trapianto di cellule ematopoietiche.Abbiamo applicato questa tecnica per studiare la legge della malattia cardio-vascolare. Ma è anche utile studiare la malignità ematologica. Questo metodo ci consente di studiare le funzioni di nuovi tipi di geni nel sistema ematopoietico in modo efficiente e elevato.Lo raccogliamo sulla disponibilità di topi transgenici.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

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Lo screening RNAi per fattori di accoglienza che partecipano Vaccinia Infezione da virus utilizzando Drosophila Celle

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Ricerca

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Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

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Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

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This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

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Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

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Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...