Name: lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

S. S. foi apoiado por uma associação americana do coração pós-doutorado Fellowship 17POST33670076. K. W. foi apoiado por concessões de NIH R01 HL138014, R01 HL141256, e R01 HL139819.

Todos os procedimentos envolvendo sujeitos animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade da Virgínia.
1. geração e purificação de partículas de Lentivirus
Nota: as partículas de Lentivirus contendo o RNA guia otimizado podem ser produzidas pelos protocolos detalhados fornecidos pela Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. Os métodos aperfeiçoados par...

<ol>
	<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells.">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li><li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+vav,+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment.">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li><li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid,+Spontaneous,+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia.">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia.">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease.">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li><li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells:+size+matters.">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li><li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL/6+Cas9+transgenic+mouse+line.">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta/NLRP3+Inflammasome.">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease.">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation.">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875 (2015).</li><li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells.">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations.">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li><li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements.">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li><li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis:+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease.">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li><li>Kahn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPM1D+truncating+mutations+confer+resistance+to+chemotherapy+and+sensitivity+to+PPM1D+inhibition+in+hematopoietic+cells.">PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells.</a> Blood. , (2018).</li></ol>

A vantagem deste protocolo é a criação de modelos animais que abriam mutações específicas em células hematopoiéticas de forma rápida e altamente rentável em comparação com as abordagens transgênicas convencionais do camundongo. Verificou-se que esta metodologia possibilita a geração de camundongos com manipulações de células hematopoiéticas dentro de 1 mês. Há diversas etapas críticas neste protocolo que exigem uma consideração mais adicional.
Triagem da sequên...

Muitos estudos em Hematologia e Imunologia dependem da disponibilidade de camundongos geneticamente modificados, incluindo camundongos convencionais e condicionais transgênicos/knock-out que utilizam condutores de CRE específicos do sistema hematopoiéticos, como Mx1-CRE, vav-CRE e outros 1,2,3,4,5. Essas estratégias exigem o estabelecimento de novas cepas de camundongo, que podem ser demoradas e onerosas financeiramente. Embora os avanços revolucionários na tecnologia de edição de genoma tenham possibilitado a geração de novas cepas de mouse em apenas 3-4 meses com a expertise técnica apropriada6,7,8,9 , muito mais tempo é exigido para amplificar a colônia do rato antes que os experimentos sejam perseguidos. Além disso, esses procedimentos são dispendiosos. Por exemplo, Jackson Laboratory lista o preço atual dos serviços de geração de ratos knock-out em $16845 por cepa (a partir de dezembro de 2018). Assim, métodos mais econômicos e eficientes do que as abordagens transgênicas murinas convencionais são mais vantajosos.
As repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas/tecnologia CRISPR associada à proteína 9 (CRISPR/Cas9) levaram ao desenvolvimento de novas ferramentas para a edição de genoma rápida e eficiente baseada em RNA, sequência específica. Originalmente descoberto como um mecanismo imunológico adaptativo bacteriano para destruir o DNA do patógeno invasor, o sistema CRISPR/Cas9 tem sido usado como uma ferramenta para aumentar a eficácia da edição do genoma em células eucarióticas e modelos animais. Várias abordagens foram empregadas para a transmissão de máquinas CRISPR/Cas9 em células-tronco hematopoiéticas (i.e., eletroporação, nucleofecção, lipofecção, parto viral e outros).
Aqui, um sistema de Lentivirus é empregado para transduce as células devido à sua capacidade de infectar eficazmente as células tronco hematopoiéticas murinas que expressam a Cas9 e empacotar juntas a construção de expressão de RNA guia, promotores, sequências regulatórias e genes que codificam proteínas de repórter fluorescente (i.e., GFP, RFP). Usando este método, a edição ex vivo do gene de pilhas de haste Hematopoietic do rato foi conseguida, seguida pela reconstituição bem sucedida da medula em ratos letalmente irradiados10. O vetor do Lentivirus empregado para este estudo expressa os genes do repórter de Cas9 e de GFP do promotor comum do núcleo EF1a com um local ribosomal interno da entrada a montante do gene do repórter. A sequência de RNA guia é expressa a partir de um promotor U6 separado. Este sistema é usado então para criar mutações da inserção e do apagamento nos genes clonal do excitador do hematopoiese do candidato Tet2 e Dnmt3a10. No entanto, a eficiência de transdução por esse método é relativamente baixa (~ 5%-10%) devido ao grande tamanho da pastilha vetorial (13 kbp) que limita a eficiência de transdução e reduz o titer de vírus durante a produção.
Em outros estudos, demonstrou-se que o maior tamanho do RNA viral afeta negativamente a produção de vírus e a eficiência de transdução. Por exemplo, um aumento de 1 KB no tamanho da pastilha é relatado para diminuir a produção de vírus em ~ 50%, e a eficiência de transdução diminuirá para mais de 50% nas células-tronco hematopoiéticas do mouse11. Assim, é vantajoso para reduzir o tamanho da inserção viral, tanto quanto possível para melhorar a eficiência do sistema.
Essa lacuna pode ser superada empregando-se camundongos transgênicos de CAS9, nos quais a proteína CAS9 é expressa de forma constitutiva ou induzível12. Os ratos de batida constitutivos de CRISPR/Cas9 expressam o endonuclease Cas9 e o EGFP do promotor de CAG no locus Rosa26 em uma maneira onipresente. Assim, uma construção com sgRNA o controle do promotor U6 e gene repórter RFP o controle do promotor EF1a núcleo pode ser entregue usando o vetor de Lentivirus para alcançar a edição do genoma. Com este sistema, os genes de células-tronco hematopoiéticas foram editados com sucesso, mostrando uma eficiência de transdução de ~ 90%. Assim, este protocolo fornece um método rápido e eficaz para criar os ratos em que as mutações genéticas alvejadas são introduzidas no sistema hematopoietic. Enquanto nosso laboratório está usando predominantemente este tipo de tecnologia para estudar o papel da hematopoiese clonal emprocessos de doença cardiovascular13,14,4,15, tambémé aplicável a estudos de hematológicos malignidade16. Além disso, este protocolo pode ser estendido à análise de como as mutações do ADN em HSPC impactam a outra doença ou processos desenvolventes no sistema hematopoietic.
Para estabelecer um sistema robusto do vetor do Lentivirus, os estoques virais do Titer elevado e as condições aperfeiçoadas para a transdução e a transplantação de pilhas hematopoietic são exigidos. No protocolo, são fornecidas instruções sobre a preparação de um estoque viral de alto título na seção 1, otimizando as condições de cultura de células-tronco hematopoiéticas murinas na seção 2, métodos para transplante de medula óssea na seção 3, e avaliando Engraftment na secção 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:936px;" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td style="width:159px;">EXELINT</td>
			<td style="width:113px;">26028</td>
			<td style="width:150px;">general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216--</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560599</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552094</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365974</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 18 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 22 G&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:159px;">Biolegend</td>
			<td style="width:113px;">100752</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100349</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9007-34-5</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">CRISPR/Cas9 knock-in mice</td>
			<td style="width:159px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:113px;">028555</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>352054</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&#160;</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>353046</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand microhematocrit capillary tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:113px;">11-0042-85</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554655</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td>
			<td style="width:159px;">Clontech</td>
			<td style="width:113px;">632636</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X qRT-PCR Titration Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV004SL</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1152-82</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI MAX</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560602</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>57823</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMG2D</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polybrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>326823</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine TPO&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>315-14</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemSpan SFEM</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>09600</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:159px;">Thermo fisher Scientific</td>
			<td>K457501</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Solution&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models

Manipular genes em células-tronco hematopoiéticas usando abordagens convencionais de transgénese pode ser demorado, caro e desafiador. Beneficiando-se de avanços na tecnologia de edição de genoma e sistemas de entrega de transgenes mediados por Lentivirus, um método eficiente e econômico é descrito aqui que estabelece camundongos em que os genes são manipulados especificamente em células-tronco hematopoiéticas. Os Lentivirus são usados para transduce células de medula óssea de linhagem negativa de expressão de Cas9 com um RNA guia (gRNA) visando genes específicos e um gene de repórter de fluorescência vermelha (RFP), então essas células são transplantadas em camundongos C57BL/6 irradiados de forma letal. Camundongos transplantados com Lentivirus expressando gRNA sem direcionamento são usados como controles. O Engraftment de pilhas de haste hematopoietic transvadas é avaliado pela análise citométrica do fluxo de leucócito RFP-positivos do sangue periférico. Usando este método, a transdução de ~ 90% de pilhas Myeloid e de ~ 70% de pilhas lymphoid em 4 semanas após a transplantação pode ser conseguida. O ADN de Genomic é isolado dos glóbulos RFP-positivos, e as porções do ADN alvejado do local são amplificadas pelo PCR para validar a edição do genoma. Este protocolo fornece uma avaliação da elevado-produção de genes hematopoiesis-reguladores e pode ser estendido a uma variedade de modelos da doença do rato com participação da pilha hematopoietic.

Usando o protocolo acima descrito, foram obtidas aproximadamente 0,8-1,0 x 108 células de medula óssea por rato. O número de células de linhagem negativa que obtemos é de aproximadamente 3 x 106 células por mouse. Tipicamente, o rendimento de células de linhagem negativa da medula óssea é de 4%-5% do total de células nucleares da medula óssea.
O chimerismo das células transvadas (RFP-positivas) ...

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Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Desenvolvemos um método eficiente e econômico para estabelecer camundongos com manipulação genética especificamente em células-tronco hematopoiéticas, usando tecnologia de edição de genomas e sistemas de entrega de transgene mediados por lentivírus. A vantagem deste protocolo é que podemos criar modelos animais que abrigam mutações específicas em células hematopoiéticas de forma rápida e econômica em comparação com abordagens transgênicas convencionais do rato. Demonstrando o procedimento estará Ying Wang, um pesquisador do meu laboratório.Para gerar partículas de lentivírus, comece codificando uma placa de seis poços com solução de colágeno e incubando-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, sementes células 293T na placa e incuba-la por mais duas horas. Enquanto isso, prepare a mistura de três plasmídeos de transfecção combinando 0,9 microgramas de vetor de lentivírus, 0,6 microgramas de psPAX2 e 0,3 microgramas de pMD2.G e deionizado para 10 microliters por poço. Em seguida, adicione cuidadosamente 50 microliters de 1X PBS e cinco microliters de PEI MAX diluídos à mistura plasmida, e incubar a mistura à temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de DMEM.Aspire a mídia a partir da placa de seis poços e adicione um mililitro de mistura plasmida a cada poço. Incubar a placa por mais três horas. Substitua a mídia por DMEM fresco e incubar por 24 horas.Adicione um mililitro de DMEM fresco e incubar mais 24 horas. Após a incubação total de 48 horas, transfira o supernascedor para um tubo de 50 mililitros e centrifuá-lo a 3000 vezes G por 15 minutos para remover quaisquer células flutuantes livres. Filtre o supernatante através de um filtro de 0,45 micrômetro e ultra-centrífuga por três horas.Aspire cuidadosamente o supernatante, deixando para trás a pelota branca. Suspenda a pelota com 100 microlitadores de meio de expansão de células hematopoiéticas sem soro sem aeração. Mantenha uma alíquota de 10 microliter para medir o título viral e armazene o resto da suspensão a menos 80 Celsius até estar pronto para usar.Depois de isolar os ossos, coloque-os em um tubo cônico de 50 mililitros com RPMI e coloque o tubo no gelo. Em um armário de biosegurança, transfira os ossos para um prato de cultura estéril de 100 milímetros. Em seguida, segure um osso com fórceps sem cortes, e use uma tesoura de dissecção para cortar cuidadosamente ambas as epífitas.Encha uma seringa de 10 mililitros com RPMI gelado e use uma agulha de calibre 22 para lavar a medula óssea do eixo em um novo prato de cultura de 100 milímetros. Depois de toda a medula óssea ter sido coletada, faça uma única suspensão celular passando a medula óssea através de uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 18. Filtre a suspensão celular através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, centrifugar o tubo de acordo com as instruções do manuscrito e aspirar o supernante. Suspenda as pelotas de célula em um volume apropriado de buffer de separação otimizado. Para isolar as células negativas da linhagem, use um kit de esgotamento de células de linhagem de acordo com as instruções do fabricante.Suspenda a linhagem isolada de células negativas no meio de expansão de células hematopoiéticas livres de soro. Pré-incubar as células a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono por duas horas. Em seguida, adicione lentivírus de acordo com as instruções do manuscrito e deixe as células na incubadora por mais 16 a 20 horas.No dia seguinte, colete as células transduzidas por lentivírus em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifuá-las a 300 vezes G por 10 minutos. De acordo com as diretrizes da NHA, é importante lidar com vetores de lentivírus no Nível Dois do Grupo Reece. Precauções devem ser tomadas, com base nos regulamentos das instalações.Aspire cuidadosamente o supernascer e suspenda a pelota em 200 microliters de RPMI por mouse. Mantenha as células em temperatura ambiente até o transplante em camundongos. Após a segunda sessão de irradiação, a injeção retro-orbital de células negativas de delineamento em cada camundongo anestesiado usando uma seringa de insulina.Três a quatro semanas após o transplante de medula óssea, obtenha amostras de sangue da veia retro-orbital usando tubos capilares. Transfira 20 microliters de sangue para tubos de teste de poliestireno de fundo redondo e coloque no gelo. Após a lise RBC, incubar as células com um coquetel de anticorpos monoclonais no escuro por 20 minutos em temperatura ambiente.Após a incubação, lave, corrija e centrifuge as células e suspenda a pelota celular em 400 microliters de tampão FACS. Mantenha as amostras a quatro graus Celsius até a análise por citometria de fluxo. O sucesso da transdução celular negativa da linhagem pode ser avaliado com detecção citométrica de fluxo de RFP.Foi demonstrado que após sete dias de cultura in vitro, em média, 75,7% das células são transduzidas. A citometria de fluxo também tem sido usada para analisar o sangue periférico do camundongo após a reconstituição com células-tronco hematopoiéticas transduzidas e não transduzidas. Uma média de 94,8% dos neutrófilos, 93,5% dos monócitos e 82,7% das células B expressam RFP.O DNA genômico das células sanguíneas RFP positivos foi amplificado e sub-clonado para análise de sequência. Várias mutações são detectadas e 69% dos clones mostram mutações fora do quadro ou de parada prematura. Para ter sucesso com este procedimento, é necessária a preparação de alto estoque antivírus e condições otimizadas para transdução e transplante de células hematopoiéticas.Aplicamos essa técnica para estudar a lei da doença cardio-vascular. Mas também é útil estudar a malignidade hematológica. Este método nos permite estudar as funções de novos tipos de genes no sistema hematopoiético de alta forma eficiente e alta.Nós reunimos isso sobre a disponibilidade de ratos transgênicos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Imunologia e Infecção

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Administração intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...