Name: lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

S. S. fue apoyado por una beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón 17POST33670076. K. W. fue apoyado por las subvenciones NIH R01 HL138014, R01 HL141256 y R01 HL139819.

Todos los procedimientos relacionados con sujetos de animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia.
1. Generación y purificación de partículas de lentivirus
NOTA: Las partículas de Lentivirus que contienen el ARN guía optimizado pueden ser producidas por los protocolos detallados proporcionados por Addgene: <https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf)...

<ol>
	<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells.">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li><li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+vav,+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment.">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li><li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid,+Spontaneous,+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia.">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia.">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease.">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li><li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells:+size+matters.">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li><li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL/6+Cas9+transgenic+mouse+line.">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta/NLRP3+Inflammasome.">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease.">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation.">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875 (2015).</li><li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells.">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations.">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li><li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements.">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li><li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis:+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease.">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li><li>Kahn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPM1D+truncating+mutations+confer+resistance+to+chemotherapy+and+sensitivity+to+PPM1D+inhibition+in+hematopoietic+cells.">PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells.</a> Blood. , (2018).</li></ol>

La ventaja de este protocolo es la creación de modelos animales que albergan mutaciones específicas en células hematopoyéticas de una manera rápida y altamente rentable en comparación con los enfoques transgénicos de ratón convencionales. Se encontró que esta metodología permite la generación de ratones con manipulaciones genéticas de células hematopoyéticas dentro de 1 mes. Hay varios pasos críticos en este protocolo que requieren una consideración adicional.
Examen de...

Muchos estudios en hematología e inmunología se basan en la disponibilidad de ratones modificados genéticamente, incluyendo ratones transgénicos/knock-out convencionales y condicionales que utilizan controladores Cre específicos del sistema hematopoyético como Mx1-Cre, Vav-Cre, y otros 1,2,3,4,5. Estas estrategias requieren el establecimiento de nuevas cepas de ratón, que pueden ser lentas y económicamente pesadas. Si bien los avances revolucionarios en la tecnología de edición del genoma han permitido la generación de nuevas cepas de ratón en tan solo 3-4 meses con la experiencia técnica adecuada6,7,8,9 , se requiere mucho más tiempo para amplificar la colonia de ratones antes de que se lleven a cabo los experimentos. Además, estos procedimientos son costosos. Por ejemplo, Jackson Laboratory enumera el precio actual de los servicios de generación de ratones noqueados en $16,845 por cepa (a diciembre de 2018). Por lo tanto, los métodos que son más económicos y eficientes que los enfoques transgénicos murinos convencionales son más ventajosos.
La tecnología de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente interesmadas/proteína asociada CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) ha llevado al desarrollo de nuevas herramientas para la edición rápida y eficiente del genoma específico de la secuencia basada en ARN. Originalmente descubierto como un mecanismo inmune adaptativo bacteriano para destruir el ADN patógeno invasor, el sistema CRISPR/Cas9 se ha utilizado como una herramienta para aumentar la eficacia de la edición del genoma en células eucariotas y modelos animales. Se han empleado varios enfoques para transmitir maquinaria CRISPR/Cas9 a células madre hematopoyéticas (es decir, electroporación, nucleofección, lipofección, parto viral y otros).
Aquí, se emplea un sistema de lentivirus para transducir las células debido a su capacidad para infectar eficazmente las células madre hematopoyéticas murinas que expresan Cas9 y empaquetar la construcción guía de la expresión de ARN, promotores, secuencias reguladoras y genes que codifican proteínas fluorescentes (es decir, GFP, RFP). Usando este método, se ha logrado la edición genética ex vivo de células madre hematopoyéticas de ratón, seguida de una reconstitución exitosa de la médula ósea en ratones irradiados letalmente10. El vector de lentivirus empleado para este estudio expresa los genes reporteros Cas9 y GFP del promotor de EF1a de núcleo común con un sitio de entrada ribosomal interno aguas arriba del gen del reportero. La secuencia de ARN guía se expresa desde un promotor U6 separado. Este sistema se utiliza entonces para crear mutaciones de inserción y eliminación en los genes conductores de hematopoyesis clonal candidatas Tet2 y Dnmt3a10. Sin embargo, la eficiencia de transducción por este método es relativamente baja (-5%-10%) debido al gran tamaño de la plaquita vectorial (13 Kbps) que limita la eficiencia de transducción y reduce el ticter del virus durante la producción.
En otros estudios, se ha demostrado que un mayor tamaño de ARN viral afecta negativamente tanto a la producción de virus como a la eficiencia de transducción. Por ejemplo, se ha informado de un aumento de 1 kb en el tamaño de la plaquita para disminuir la producción de virus en un 50 %, y la eficiencia de transducción disminuirá a más del 50 % en las células madre hematopoyéticas del ratón11. Por lo tanto, es ventajoso reducir el tamaño del inserto viral tanto como sea posible para mejorar la eficiencia del sistema.
Esta deficiencia puede superarse empleando ratones transgénicos Cas9, en los que la proteína Cas9 se expresa de manera constitutiva o inductible12. Los constitutivos ratones knock-in CRISPR/Cas9 expresan la endonucleasa Cas9 y el EGFP del promotor CAG en el locus Rosa26 de una manera omnipresente. Por lo tanto, una construcción con sgRNA bajo el control del gen promotor U6 y reportero RFP bajo el control del promotor central EF1a puede ser entregada usando el vector lentivirus para lograr la edición del genoma. Con este sistema, los genes de las células madre hematopoyéticas han sido editados con éxito, mostrando una eficiencia de transducción del 90%. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método rápido y eficaz para crear ratones en los que se introducen mutaciones genéticas dirigidas en el sistema hematopoyético. Mientras que nuestro laboratorio está utilizando predominantemente este tipo de tecnología para estudiar el papel de la hematopoyesis clonal en los procesos de enfermedades cardiovasculares13,14,15, también es aplicable a los estudios de hematológico neoplasia maligna16. Además, este protocolo puede extenderse al análisis de cómo las mutaciones de ADN en HSPC afectan a otras enfermedades o procesos de desarrollo en el sistema hematopoyético.
Para establecer un sistema de vectores de lentivirus robusto, se requieren existencias virales de alta titer y condiciones optimizadas para la transducción y el trasplante de células hematopoyéticas. En el protocolo, se proporcionan instrucciones sobre la preparación de un stock viral de alto títer en la sección 1, optimizando las condiciones de cultivo de las células madre hematopoyéticas murinas en la sección 2, los métodos para el trasplante de médula ósea en la sección 3, y la evaluación de las injerto en la sección 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:936px;" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td style="width:159px;">EXELINT</td>
			<td style="width:113px;">26028</td>
			<td style="width:150px;">general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216--</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560599</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552094</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365974</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 18 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 22 G&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:159px;">Biolegend</td>
			<td style="width:113px;">100752</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100349</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9007-34-5</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">CRISPR/Cas9 knock-in mice</td>
			<td style="width:159px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:113px;">028555</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>352054</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&#160;</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>353046</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand microhematocrit capillary tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:113px;">11-0042-85</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554655</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td>
			<td style="width:159px;">Clontech</td>
			<td style="width:113px;">632636</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X qRT-PCR Titration Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV004SL</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1152-82</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI MAX</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560602</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>57823</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMG2D</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polybrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>326823</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine TPO&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>315-14</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemSpan SFEM</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>09600</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:159px;">Thermo fisher Scientific</td>
			<td>K457501</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Solution&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models

Manipular genes en células madre hematopoyéticas utilizando enfoques de transgénesis convencionales puede llevar mucho tiempo, ser costoso y desafiante. Beneficiándose de los avances en la tecnología de edición del genoma y los sistemas de administración de transgenes mediados por lentivirus, aquí se describe un método eficiente y económico que establece ratones en los que los genes se manipulan específicamente en células madre hematopoyéticas. Los lentivirus se utilizan para transducir células de médula ósea negativas al linaje Cas9 con un ARN guía (GRNA) dirigido a genes específicos y un gen reportero de fluorescencia roja (RFP), luego estas células se trasplantan en ratones C57BL/6 irradiados letalmente. Los ratones trasplantados con lentivirus que expresan un gRNA no objetivo se utilizan como controles. El injerto de células madre hematopoyéticas transducidas se evalúa mediante el análisis citométrico de flujo de leucocitos rFP positivos de sangre periférica. Usando este método, se puede lograr una transducción del 90 % de células mieloides y un 70 % de las células linfoides a las 4 semanas después del trasplante. El ADN genómico está aislado de las células sanguíneas positivas para rFP, y partes del ADN del sitio objetivo son amplificadas por PCR para validar la edición del genoma. Este protocolo proporciona una evaluación de alto rendimiento de los genes reguladores de la hematopoyesis y se puede extender a una variedad de modelos de enfermedad esratonera con afectación de células hematopoyéticas.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se han obtenido aproximadamente 0.8-1.0 x 108 células de médula ósea por ratón. El número de celdas negativas de linaje que obtenemos es de aproximadamente 3 x 106 celdas por ratón. Típicamente, el rendimiento de las células negativas del linaje de la médula ósea es del 4%-5% del total de las células nucleares de la médula ósea.
El chimerismo de l...

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Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Hemos desarrollado un método eficiente y económico para establecer ratones con manipulación génica específicamente en células madre hematopoyéticas, utilizando la tecnología de edición del genoma y sistemas de administración de transgén mediados por lentivirus. La ventaja de este protocolo es que podemos crear modelos animales que albergan mutaciones específicas en células hematopoyéticas de una manera rápida y rentable en comparación con los enfoques transgénicos convencionales de ratón. Demostrando el procedimiento estará Ying Wang, un investigador de mi laboratorio.Para generar partículas de lentivirus, comience codificando una placa de seis pozos con solución de colágeno e incubando a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante 30 minutos. Luego, siembra células 293T en la placa e incuba durante otras dos horas. Mientras tanto, preparar la mezcla de tres plásmidos de transfección combinando 0,9 microgramos de lentivirus vector, 0,6 microgramos de psPAX2 y 0,3 microgramos de pMD2.G y desionizado a 10 microlitros por pozo. A continuación, añadir cuidadosamente 50 microlitros de 1X PBS y cinco microlitros de PEI MAX diluido a la mezcla de plásmido, e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de DMEM.Aspirar el medio de la placa de seis pozos y añadir un mililitro de mezcla de plásmido a cada pozo. Incubar el plato durante otras tres horas. Sustituya el soporte por DMEM fresco e incubar durante 24 horas.Añadir un mililitro de DMEM fresco e incubar 24 horas adicionales. Después de una incubación total de 48 horas, transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros y centrifugarlo a 3000 veces G durante 15 minutos para eliminar las células flotantes libres. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micrómetros y ultra-centrifugarlo durante tres horas.Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando atrás el pellet blanco. Re-suspenda el pellet con 100 microlitros de medio de expansión celular hematopoyética sin suero sin aireación. Mantenga una alícuota de 10 microlititer para medir el título viral y almacene el resto de la suspensión en menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para usar.Después de aislar los huesos, colóquelos en un tubo cónico de 50 mililitros con RPMI y coloque el tubo sobre hielo. En un gabinete de biosemase, transfiera los huesos a un plato estéril de cultivo de 100 milímetros. A continuación, agarre un hueso con fórceps contundentes y use tijeras de disección para cortar cuidadosamente ambas epífisis.Llene una jeringa de 10 mililitros con RPMI helada y utilice una aguja de calibre 22 para lavar la médula ósea del eje en un nuevo plato de cultivo de 100 milímetros. Después de recoger toda la médula ósea, haga una suspensión de una sola célula pasando la médula ósea a través de una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 18. Filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.A continuación, centrifugar el tubo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender los pellets celulares en un volumen adecuado de búfer de separación optimizado. Para aislar las células negativas del linaje, utilice un kit de agotamiento de células de linaje de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Re-suspenda las células negativas de linaje aislado en un medio de expansión de células hematopoyéticas sin suero. Pre-incubar las células a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono durante dos horas. Luego agregue lentivirus de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y deje las células en la incubadora durante otras 16 a 20 horas.Al día siguiente, recoger las células transducidas por lentivirus en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugarlas a 300 veces G durante 10 minutos. De acuerdo con las directrices de la NHA, es importante manejar los vectores de lentivirus en el nivel dos del Grupo Reece. Se deben tomar precauciones, de acuerdo con las regulaciones de la instalación.Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 200 microlitros de RPMI por ratón. Mantenga las células a temperatura ambiente hasta el trasplante en ratones. Después de la segunda sesión de irradiación, inyecte retro-orbitalmente células negativas delineatorias transducidas en cada ratón anestesiado utilizando una jeringa de insulina.De tres a cuatro semanas después del trasplante de médula ósea, obtenga muestras de sangre de la vena retro-orbital utilizando tubos capilares. Transfiera 20 microlitros de sangre a tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo y colóquelos sobre hielo. Después de la lelisis RBC, incubar las células con un cóctel de anticuerpos monoclonales en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente.Después de la incubación, lavar, fijar y centrifugar las células y volver a suspender el pellet celular en 400 microlitros de tampón FACS. Mantenga las muestras a cuatro grados centígrados hasta su análisis por citometría de flujo. El éxito de la transducción de células negativas de linaje se puede evaluar con la detección citométrica de flujo de RFP.Se ha demostrado que después de siete días de cultivo in vitro, en promedio, 75,7% de las células son transducidas. La citometría de flujo también se ha utilizado para analizar la sangre periférica del ratón después de la reconstitución con células madre hematopoyéticas transducidas y no transducidas. Un promedio de 94,8% de los neutrófilos, 93,5% de los monocitos y 82,7% de las células B expresan RFP.El ADN genómico de las células sanguíneas positivas rfP ha sido amplificado por PCR y subclorado para el análisis de secuencia. Se detectan varias mutaciones y el 69% de los clones muestran mutaciones fuera de fotograma o de parada prematura. Para tener éxito con este procedimiento, se requiere la preparación de un alto stock antivirus y condiciones optimizadas para la transducción y trasplante de células hematopoyéticas.Hemos aplicado esta técnica para estudiar la ley de la enfermedad cardiovascular. Pero también es útil estudiar la neoplasia maligna hematológica. Este método nos permite estudiar las funciones de nuevos tipos de genes en el sistema hematopoyético de alta eficiencia y alta manera.Reunimos esto sobre la disponibilidad de ratones transgénicos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi detección de los factores del huésped implicados en Vaccinia Infección del virus utilizando Drosophila Celdas

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Administración intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...