Name: lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

S. S. stöddes av ett amerikanskt hjärta Association postdoktor Fellowship 17POST33670076. K. W. stöddes av NIH Grants R01 HL138014, R01 HL141256, och R01 HL139819.

Alla förfaranden som involverar djur försökspersoner har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Virginia.
1. generering och rening av lentivirus partiklar
Anmärkning: lentivirus partiklar som innehåller den optimerade guide RNA kan produceras av detaljerade protokoll från Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. Optimerade metoder för hög titer lentiv...

<ol>
	<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells.">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li><li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+vav,+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment.">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li><li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid,+Spontaneous,+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia.">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia.">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease.">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li><li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells:+size+matters.">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li><li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL/6+Cas9+transgenic+mouse+line.">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice.">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li><li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta/NLRP3+Inflammasome.">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li><li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease.">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation.">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875 (2015).</li><li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells.">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations.">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li><li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements.">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li><li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis:+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease.">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li><li>Kahn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPM1D+truncating+mutations+confer+resistance+to+chemotherapy+and+sensitivity+to+PPM1D+inhibition+in+hematopoietic+cells.">PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells.</a> Blood. , (2018).</li></ol>

Fördelen med detta protokoll är skapandet av djurmodeller härda specifika mutationer i hematopoietiska celler på ett snabbt och mycket kostnadseffektivt sätt jämfört med konventionella mus transgena metoder. Det konstaterades att denna metod möjliggör generering av möss med hematopoietiska cell gen-manipulationer inom 1 månad. Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som kräver ytterligare övervägande.
Screening av gRNA-sekvens
...

Många studier i hematologi och immunologi förlitar sig på tillgången på genetiskt modifierade möss, inklusive konventionella och villkorliga transgena/knock-out möss som utnyttjar hematopoietiska systemspecifika CRE förare såsom Mx1-CRE, VAV-CRE, och andra 1,2,3,4,5. Dessa strategier kräver inrättandet av nya mus stammar, vilket kan vara tidskrävande och ekonomiskt belastande. Medan revolutionära framsteg i genom redigering teknik har möjliggjort generering av nya möss stammar i så få som 3-4 månader med lämplig teknisk expertis6,7,8,9 , mycket mer tid krävs för att förstärka musen kolonin innan experiment eftersträvas. Dessutom är dessa förfaranden kostsamma. Till exempel listar Jackson Laboratory det nuvarande priset på Knock-out möss generation tjänster på $16 845 per stam (från och med december 2018). Således är metoder som är mer ekonomiska och effektiva än konventionella murina transgena metoder mer fördelaktiga.
Kluster med jämna mellanrum korta palindrom repetitioner/CRISPR Associated protein 9 (CRISPR/Cas9) teknik har lett till utveckling av nya verktyg för snabb och effektiv RNA-baserad, sekvens-specifik genomredigering. Ursprungligen upptäcktes som en bakteriell adaptiv immunmekanism för att förstöra invaderande patogen DNA, den CRISPR/Cas9 systemet har använts som ett verktyg för att öka effektiviteten av genomredigering i eukaryota celler och djurmodeller. Ett antal metoder har använts för att överföra CRISPR/Cas9 maskiner till hematopoietiska stamceller (dvs., elektroporation, nukleofektion, lipofektion, viral leverans, och andra).
Här är ett lentivirus system används för att transduce celler på grund av dess förmåga att effektivt infektera Cas9-uttrycker murina hematopoietiska stamceller och paketera tillsammans guide RNA uttryck konstruera, initiativtagare, regulatoriska sekvenser, och gener som kodar fluorescerande reporter proteiner (dvs., GFP, RFP). Med denna metod har ex vivo genredigering av mus hematopoietiska stamceller uppnåtts, följt av framgångsrik beredning av benmärg i dödligt bestrålade möss10. Den lentivirus Vector används för denna studie uttrycker Cas9 och GFP reporter gener från den gemensamma kärnan EF1a promotorn med en intern ribosomal inträde webbplats uppströms från reportern genen. Guide-RNA-sekvensen uttrycks från en separat U6-promotor. Detta system används sedan för att skapa införande och radering mutationer i kandidat klon hematopoies föraren gener Tet2 och Dnmt3a10. Dock är transduktionseffektiviteten med denna metod relativt låg (~ 5%-10%) på grund av den stora storleken på Vector insatsen (13 KBP) som begränsar transduktionseffektiviteten och reducerar virusets titer under produktionen.
I andra studier, det har visats att större viral RNA-storlek negativt påverkar både virus produktion och signaltransduktion effektivitet. Till exempel, en 1 KB ökning av skär storlek rapporteras att minska virus produktionen av ~ 50%, och transduktion effektivitet kommer att minska till mer än 50% i mus hematopoietiska stamceller11. Därför är det fördelaktigt att minska storleken på virus insatsen så mycket som möjligt för att förbättra systemets effektivitet.
Denna brist kan övervinnas genom att anställa Cas9 transgena möss, där Cas9 proteinet uttrycks i antingen ett konstitutivt eller inducerbart sätt12. De konstitutiva CRISPR/Cas9-Knock-in-möss uttrycker Cas9 endonukleas och EGFP från CAG-promotorn på Rosa26 Locus på ett allestädande sätt. Således, en konstruktion med sgRNA under kontroll av U6 promotorn och RFP reporter genen under kontroll av Core EF1a promotorn kan levereras med hjälp av lentivirus vektorn för att uppnå genomredigering. Med detta system har gener av hematopoietiska stamceller framgångsrikt redigerats, visar en ~ 90% signaltransduktion effektivitet. Detta protokoll ger således en snabb och effektiv metod för att skapa möss där riktade genmutationer introduceras i det hematopoietiska systemet. Medan vårt labb huvudsakligen använder denna typ av teknik för att studera den roll som klonala hematopoies i hjärt-kärlsjukdomar processer13,54,15, det är också tillämplig på studier av hematologiska malignitet16. Dessutom kan detta protokoll utvidgas till analysen av hur DNA-mutationer i HSPC påverkar andra sjukdoms-eller utvecklingsprocesser i det hematopoietiska systemet.
För att etablera ett robust lentivirus Vector system, hög titer viral lager och optimerade villkor för transduktion och transplantation av hematopoietiska celler krävs. I protokollet ges instruktioner om beredning av en hög titervirusstock i avsnitt 1, optimering av odlingsförhållandena för murina hematopoietiska stamceller i avsnitt 2, metoder för benmärgstransplantation i avsnitt 3 och bedömning av inympelse i avsnitt 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:936px;" width="935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td>
			<td style="width:159px;">EXELINT</td>
			<td style="width:113px;">26028</td>
			<td style="width:150px;">general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216--</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560599</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552094</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365974</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 18 G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precisionglide needle, 22 G&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:159px;">Biolegend</td>
			<td style="width:113px;">100752</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100349</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9007-34-5</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">CRISPR/Cas9 knock-in mice</td>
			<td style="width:159px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:113px;">028555</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>353003</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>352054</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&#160;</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>353046</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand microhematocrit capillary tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:113px;">11-0042-85</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554655</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td>
			<td style="width:159px;">Clontech</td>
			<td style="width:113px;">632636</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothesia (Isoflurane) solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X qRT-PCR Titration Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHV004SL</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1152-82</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI MAX</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602F</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560602</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>57823</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMG2D</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polybrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>326823</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RadDisk &#8211; Rodent Irradiator Disk</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>IRD-P M</td>
			<td>general supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine TPO&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>315-14</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemSpan SFEM</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>09600</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:159px;">Thermo fisher Scientific</td>
			<td>K457501</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Solution&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral crispr/cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models

Manipulera gener i hematopoietiska stamceller med hjälp av konventionella transgenetik metoder kan vara tidskrävande, dyrt och utmanande. Dra nytta av framsteg i genom redigering teknik och lentivirus-medierade transgenens leveranssystem, en effektiv och ekonomisk metod beskrivs här som etablerar möss där gener manipuleras specifikt i hematopoietiska stamceller. Lentivirus används för att transduce Cas9-uttrycker härstamning-negativa benmärgsceller med en guide RNA (gRNA) inriktning på specifika gener och en röd fluorescens reporter gen (RFP), då dessa celler transplanteras till lethally-bestrålade C57BL/6 möss. Möss som transplanteras med lentivirus som uttrycker icke-riktad gRNA används som kontroller. Engrafering av sensorik hematopoietiska stamceller utvärderas genom flödescytometrisk analys av RFP-positiva leukocyter av perifert blod. Med denna metod, ~ 90% transduktion av myeloida celler och ~ 70% av lymfoida celler vid 4 veckor efter transplantation kan uppnås. Genomiskt DNA isoleras från RFP-positiva blodceller, och delar av det riktade DNA-området förstärks av PCR för att validera genomedigering. Detta protokoll ger en hög genomströmning utvärdering av hematopoies-reglerande gener och kan utvidgas till en mängd olika modeller mus sjukdom med hematopoietisk cell inblandning.

Med hjälp av det ovan beskrivna protokollet, cirka 0,8-1,0 x 108 benmärgsceller per mus har erhållits. Antalet härstamning-negativa celler vi får är cirka 3 x 106 celler per mus. Typiskt, avkastningen av benmärgen härstamning-negativa celler är 4%-5% av den totala benmärgs kärn celler.
Chimerism av sensorik celler (RFP-positiva) utvärderas genom flödescytometri av perifert blod (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models at JoVE.com

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Beskrivna är protokoll för mycket effektiv genom redigering av murina hematopoietiska Stem och stamceller (HSPC) av CRISPR/Cas9 systemet för att snabbt utveckla musmodell system med hematopoietiska systemspecifika genmodifieringar.

Lentiviral CRISPR/Cas9-medierad genom redigering för studiet av hematopoietiska celler i sjukdomsmodeller

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Vi har utvecklat en effektiv och ekonomisk metod för att etablera möss med genmanipulation specifikt i hematopoetiska stamceller, Med hjälp av genomredigeringsteknik och lentivirusmedierade transgena leveranssystem. Fördelen med detta protokoll är att vi kan skapa djurmodeller hysa specifika mutationer i hematopoitiska celler på ett snabbt och kostnadseffektivt sätt jämfört med konventionella mustransgena metoder. Demonstrerar proceduren blir Ying Wang, en forskare från mitt laboratorium.För att generera lentiviruspartiklar, börja med att koda en sex brunnsplatta med kollagenlösning och inkubera den i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 30 minuter. Sedan, frö 293T celler på plattan och inkubera den i ytterligare två timmar. Under tiden förbereda blandningen av tre transfection plasmider genom att kombinera 0,9 mikrogram lentivirus vektor, 0,6 mikrogram psPAX2 och 0,3 mikrogram pMD2.G och avjoniseras till 10 mikroliter per brunn. Tillsätt sedan försiktigt 50 mikroliter av 1X PBS och fem mikroliter av utspädd PEI MAX till plasmidblandningen, och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 15 minuter. Efter inkubationen, tillsätt en milliliter av DMEM.Aspirera media från sex brunnsplattan och tillsätt en milliliter av plasmid blandning till varje brunn. Inkubera plattan i ytterligare tre timmar. Byt ut media med färsk DMEM och inkubera i 24 timmar.Tillsätt en milliliter färsk DMEM och inkubera ytterligare 24 timmar. Efter total inkubation på 48 timmar, överför supernatanten till ett 50 milliliterrör och centrifugerar det vid 3000 gånger G i 15 minuter för att avlägsna eventuella fritt flytande celler. Filtrera supernatanten genom ett 0,45 mikrometerfilter och ultra-centrifug det i tre timmar.Aspirera försiktigt supernatanten och lämnar kvar den vita pelleten. Åter upphäva pelleten med 100 mikroliter av serumfria hematopoetiska cell expansionsmedium utan aeration. Håll en 10 microliter alikvot för att mäta viral titer och lagra resten av suspensionen på minus 80 Celsius tills den är klar att använda.Efter att ha isolerat benen, placera dem i en 50 milliliter koniska röret med RPMI och placera röret på is. I ett biosäkerhetsskåp överför du benen till en steril 100-millimeterskulturskål. Sedan greppa ett ben med trubbiga tlysnor, och använd dissekering sax för att noggrant skära båda epifyser.Fyll en 10 milliliter spruta med iskall RPMI och använd en 22 gauge nål för att spola benmärgen från skaftet i en ny 100 millimeter kultur skålen. Efter allt benmärgen har samlats in, gör en enda cell suspension genom att passera benmärgen genom en 10 milliliter spruta med en 18 gauge nål. Filtrera cellupphängningen genom en 70 mikrometercellsil i ett koniskt rör på 50 milliliter.Därefter centrifugera röret enligt manuskriptriktningarna och aspirera supernatanten. Åter upphäva cell pellets i en lämplig volym av optimerad separation buffert. För att isolera härstamning negativa celler, använd en härstamning cell utarmning kit enligt tillverkarens instruktioner.Re-suspend de isolerade härstamning negativa celler i serum-fri hematopoietic cell expansionsmedium. Förinkubera cellerna i 37 grader celsius i 5%koldioxid i två timmar. Lägg sedan till lentivirus enligt manuskriptriktningarna och lämna cellerna i inkubatorn i ytterligare 16 till 20 timmar.Nästa dag, samla in lentivirus-transduced celler i en 15 milliliter koniska röret och centrifug dem på 300 gånger G i 10 minuter. Enligt NHA:s riktlinjer är det viktigt att hantera lentivirusvektorer på Reece Group nivå två. Försiktighetsåtgärder måste vidtas, baserat på facilitetsbestämmelser.Aspirera försiktigt supernatanten och åter upphäva pelleten i 200 mikroliter av RPMI per mus. Håll cellerna i rumstemperatur tills transplantation till möss. Efter den andra bestrålning session, retro-orbitally injicera transduced delineage negativa celler i varje sövda musen med hjälp av en insulin spruta.Tre till fyra veckor efter benmärgstransplantation, erhålla blodprov från retro-orbital vein med hjälp av kapillär rör. Överför 20 mikroliter blod i runda-botten polystyren provrör och placera på is. Efter RBC-lys, inkubera cellerna med en cocktail av monoklonala antikroppar i mörker i 20 minuter vid rumstemperatur.Efter inkubation, tvätta, fixera och centrifugera cellerna och åter upphäva cellpelletsen i 400 mikroliter FACS-buffert. Håll proverna på fyra grader Celsius tills analys genom flödescytometri. Framgång av härstamning negativ celltransduktion kan utvärderas med flöde cytometrisk detektion av RFP.Det har visats att efter sju dagar av in vitro-kultur, i genomsnitt, 75,7% av celler transduced. Flödescytometri har också använts för att analysera mus perifert blod efter rekonstitution med transduced och icke-transduced hematopoietic stamceller. I genomsnitt 94,8%av neutrofiler, 93,5%av monocyter, och 82,7%av B-celler uttrycker RFP.Genomiskt DNA från de RFP-positiva blodkropparna har pcr amplifierats och sub-klonats för sekvensanalys. Olika mutationer upptäcks och 69%av klonerna visar ur ramen eller för tidigt stoppa mutationer. För att lyckas med detta förfarande krävs beredning av höga antiviruslager och optimerade villkor för transduktion och transplantation av hematopoetiska celler.Vi har tillämpat denna teknik för att studera lagen om i hjärt-kärlsjukdom. Men det är också användbart att studera blodsjukdomar malignitet. Denna metod gör det möjligt för oss att studera funktioner av nya typer av gener i hematopoietiska systemet på hög effektivt och högt sätt.Vi samlar detta över tillgängligheten av transgena möss.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi screening för Host faktorer som Vaccinia Virus Infektion med Drosophila Celler

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Kolonibildande Cell (CFC)-analys för mänskliga hematopoetiska celler

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Särskild märkning av HIV-1 positiva celler med hjälp av en Rev-beroende Lentiviral Vector uttrycka det grönt fluorescerande proteinet

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Bedöma utvecklingen av murina plasmacytoid dendritiska celler i Peyers Patches Använda adoptiv överföring av hematopoetiska stamfäder

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratrakeal administration<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; I musmodeller för att studera Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder för att studera Lipidförändringarna i neutrofiler och efterföljande bildning av neutrofila Extracellulär Fällor

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...