Name: quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi takker medlemmerne af Neumann Lab for værdifulde diskussioner og input. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH kontor for forskning infrastrukturprogrammer (P40 OD010440). Forfatterne takker WormBase for sin rigdom af information om C. elegans, og anerkender Monash Micro Imaging, Monash University, for tilvejebringelse af instrumentering, uddannelse og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af CMTAA-forskningsstipendier (2015 og 2018), og NHMRC-projekttilskud 1101974 og 1099690 blev tildelt B.N.

1. vækst og vedligeholdelse af C. elegans stammer
<ol><li>Seed nematode vækst medium (NGM, se tabel over materialer) agar plader med 300 μl af den langsomt voksende E. coli stamme OP50 i et laminar flow kabinet.</li>
	<li>Lad NGM-agarpladerne i laminar flow kabinettet tørre. Bemærk: i fravær af laminar flow kabinet, kan pladerne overlades til at tørre på bænken, men de er mere tilbøjelige til kontaminering.</li>
	<li>Overfør mindst 20 dyr til hver af de to OP50-seeded NG...

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. , (1974).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. , (2017).</li><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+C.+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer's+disease+and+other+neurodegenerative+diseases.">Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Genetics. , (2014).</li><li>Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Proteins+Act+as+Transcriptional+Guarantors+to+Ensure+Terminal+Differentiation.">Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation.</a> Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).</li><li>Koushika, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Caenorhabditis+elegans+cytoplasmic+dynein+components+reveal+specificity+of+neuronal+retrograde+cargo.">Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo.</a> Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).</li><li>Byrne, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+dynamics+affects+behaviour+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li><li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+High-Resolution+Second-Harmonic+Generation+Imaging+of+Endogenous+Structural+Proteins+in+Biological+Tissues.">Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ilastik:+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit.">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+image+restoration+and+segmentation:+A+generalized+linear+model/bregman+perspective.">Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective.</a> International Journal of Computer Vision. , (2013).</li><li>Rizk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantification+of+subcellular+structures+in+fluorescence+microscopy+images+using+Squassh.">Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh.</a> Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).</li><li>Akella, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEC-17+is+an+alpha-tubulin+acetyltransferase.">MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase.</a> Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).</li><li>Neumann, B., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MEC-17+leads+to+microtubule+instability+and+axonal+degeneration.">Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration.</a> Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).</li><li>Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+alpha-tubulin+K40+acetyltransferase+alphaTAT1+promotes+rapid+ciliogenesis+and+efficient+mechanosensation.">The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).</li><li>Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maintenance+of+synaptic+structure+is+mediated+by+the+alpha-tubulin+acetyltransferase+MEC-17/&#945;TAT1.">Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/&#945;TAT1.</a> bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).</li><li>Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+mitofusin-2+in+health+and+disease.">Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease.</a> Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).</li><li>Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+genes+associated+with+Charcot-Marie-Tooth+type+2+lead+to+common+behavioural,+cellular+and+molecular+defects+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 605584 (2019).</li><li>Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+has+membrane+constricting+and+severing+abilities+sufficient+for+mitochondrial+and+peroxisomal+fission.">Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission.</a> Nature Communications. , (2018).</li><li>Zhu, P. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+Intermolecular+Domain+Interactions+of+the+C-terminal+GTPase+Effector+Domain+of+the+Multimeric+Dynamin-like+GTPase+Drp1.">Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).</li><li>Osellame, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+the+Drp1+adaptors+Mff,+MiD49+and+MiD51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission.</a> Journal of Cell Science. , (2016).</li><li>Dima, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+segmentation+algorithms+for+fluorescence+microscopy+images+of+cells.">Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells.</a> Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).</li><li>Trevisan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+Mitochondria+Dynamics+Reveals+Separate+Roles+for+Form+and+Function+in+Mitochondria+Distribution.">Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution.</a> Cell Reports. , (2018).</li></ol>

Morfologiske variationer er ofte blevet vurderet via manuel optælling af mærkbare forskelle eller ved hjælp af vilkårlige tærskler for at bestemme defekter i forhold til en vildtype fænotype. For nylig er der imidlertid blevet anvendt kvantitative metoder til sammenlignende undersøgelser af morfologi for nøjagtigt at måle og beskrive ændringer på et cellulært og subcellulært niveau på en upartisk måde. Evnen til at identificere subtile, men biologisk relevante forskelle mellem fænotyper er et effektivt mi...

Fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) udnyttes i stigende grad som et model system til at afdække de biologiske og molekylære processer, der er involveret i sygdomme hos mennesker. En voksen fyrretræsnematoden har en kropslængde på lidt over 1 mm, og kan producere en stor yngel på op til 300 æg1. Efter klækning kræver C. elegans kun 3-4 dage for at nå voksenalderen, og leve i omkring 2 til 3 uger2. På grund af sin lethed af dyrkning, C. elegans er i øjeblikket en af de mest eftertragtede in vivo dyremodeller for at gennemføre omkostningseffektiv, hurtig Drug screening for at identificere Therapeutics for menneskelige sygdomme. Desuden, dens genetiske bevaring, veldefinerede adfærdsmæssige paradigmer, gennemsigtige organ for fluorescens eller lys mikroskopi, og nem genetisk manipulation gør studiet af cellulære og molekylære konsekvenser af genetiske mutationer let opnåelige 3. C. elegans genom deler ca. 60-80% ortologi med menneskelige gener, og omkring 40% af disse gener er kendt for at være sygdomsrelaterede. Nogle af menneskelige sygdomme, der er blevet modelleret og undersøgt i C. elegans omfatter neurodegenerative lidelser (Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-tandsygdom), muskel-associerede sygdomme ( Duchenne muskeldystrofi), og metaboliske sygdomme (hyperglykæmi)2,4. I de fleste menneskelige lidelser opstår sygdoms induceret cellulær og organelle lokalisering og morfologiske forandringer, som let kan evalueres i fyrretræsnematoden modellen.
Fluorescerende markører har været meget brugt til at mærke væv og organeller til dynamisk visualisering under mikroskopet. Men i C. elegans, konventionelle metoder, der vurderer morfologiske uregelmæssigheder på grund af genetiske mutationer har i vid udstrækning påberåbt sig visuelle beskrivelser. Mens kvalitative vurderinger kan dække bredere intervaller af fænotypiske beskrivelser (synaptisk morfologi, GFP clumping, specifik axonal form, muskel fiber tykkelse, etc.) og give et fugleperspektiv af de morfologiske ændringer, de er mindre velegnede til sammenligning af små variationer på tværs af forskellige grupper. Desuden er kvalitative vurderinger baseret på visuel, subjektiv vurdering, hvilket kan føre til over-eller under estimeringer af morfologiske abnormiteter. Endelig kan kvalitative observationer også variere meget mellem individer, hvilket skaber problemer med datareplikering.
I de seneste år er der udviklet en række brugervenlige, let tilgængelige beregningsmæssige algoritmer, som kan analysere billeder kvantitativt. Men udnyttelsen af en sådan billedanalyse software til nogle morfologiske undersøgelser, især i forhold til kropsvæg muskler og mitokondrier, i C. elegans forskning har haltet bagud. For at forbedre underliggende strukturel analyse i C. elegans, nogle af de let tilgængelige, open-source billedanalyse software blev ved til kvantitativt sammenligne virkningerne af genetiske mutationer på muskel mitokondrier, Body Wall muskel og synaptisk Morfologi. Disse eksperimentelle procedurer skitsere i detaljer, hvordan disse programmer (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan bruges til at evaluere ændringer i synaptisk størrelse og synaptisk protein lokalisering, Body Wall muskel område og fiberlængde, og mitokondrie størrelse og cirkularitet som følge af genetiske mutationer i nematoden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01614.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Inverted platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>Zeiss Axio Imager M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENCS22221GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1.5</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>Made by SCHOTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENS41104A/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KL 300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (Peptone from casein)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107213</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Peptone from meat)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107214</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105101</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106586</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS7095D5X-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430589-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>267201-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Met-app</td>
			<td>2616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9756-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans

Definition af cellulære mekanismer underliggende sygdom er afgørende for udviklingen af nye Therapeutics. En strategi, der ofte bruges til at afdække disse mekanismer, er at introducere mutationer i kandidat gener og kvalitativt beskrive ændringer i morfologien af væv og celle organeller. Kvalitative beskrivelser kan dog ikke opfange subtile fænotypiske forskelle, kunne forvanske fænotypiske variationer på tværs af individer i en population og ofte vurderes subjektivt. Her beskrives kvantitative tilgange til at studere morfologien af væv og organeller i fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans ved hjælp af Laserscanning confokal mikroskopi kombineret med kommercielt tilgængelige bio-image behandling software. En kvantitativ analyse af fænotyper, der påvirker synapse integritet (størrelse og integreret fluorescens niveauer), muskel udvikling (muskel Cellestørrelse og myosin filament længde), og mitokondrie morfologi (cirkularitet og størrelse) blev udført for at forstå virkningerne af genetiske mutationer på disse cellulære strukturer. Disse kvantitative tilgange er ikke begrænset til de anvendelser, der er beskrevet her, da de let kunne anvendes til kvantitativt at vurdere morfologien af andre væv og organeller i nematoden samt i andre modelorganismer.

C. elegans er en ideel model organisme til at studere morfologi af forskellige væv og organeller på grund af sin enkelhed, kendt celle Lineage, gennemsigtighed, og tilgængelige værktøjer. Her giver vi kvantitative tilgange til at studere organeller (f. eks. mitokondrier) og væv, herunder synapser og muskler ved hjælp af levende fluorescens Imaging og gratis bio-billedbehandling software.
Streng regulering...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Kvantitative tilgange til at studere cellulære strukturer og organelle morfologi i Caenorhabditis elegans

Denne undersøgelse skitserer kvantitative målinger af synaptisk størrelse og lokalisering, muskel morfologi, og mitokondrie form i C. elegans ved hjælp af frit tilgængelige billedbehandling værktøjer. Denne fremgangsmåde gør det muligt for fremtidige studier i C. elegans at sammenligne omfanget af vævs-og organelle strukturændringer som følge af genetiske mutationer.

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Evnen til at kvantificere ændringer i morfologien af væv og organeller er vigtig for at forstå genfunktion samt virkningen af genetiske mutationer. Vores protokoller forklarer, hvordan frit tilgængelig software kan bruges til ikke-subjektivt vurdering af morfologi synapser, muskler og mitokondrier i en nematode, C.elegans. Mange tidligere undersøgelser har været baseret på kvalitative metoder til sammenligning af morfologiske ændringer.Men, disse kan være problematisk, da de ikke kan fange subtile fænokomypiske forskelle, kan over og undervurdere ændringer, og vurderes subjektivt. Vores kvantitative metoder giver mere robuste og mindre forudindtagede midler til vurdering af morfologiske ændringer. Disse metoder kan let anvendes til at studere morfologiske ændringer i andre cellulære strukturer eller modelorganismer med henblik på at definere genfunktionen og konsekvenserne af sygdomsrelaterede mutationer.Start med at forberede slides til billedbehandling. Placer en dråbe en smeltet agarose på et mikroskop dias og straks trykke ned dråben med en anden mikroskop dias, forsigtigt udfladning af agarose. Lad agarose tørre i et minut derefter forsigtigt adskille de to dias og lad størknede pad på en af dias.Placer dias på mikroskop scenen og tilsæt en fem til 10-milliliter dråbe bedøvelsesmiddel til midten af agarose pad. Brug en varmesteriliseret pick til hurtigt at overføre 10 til 15 dyr fra lagerpladen til bedøvelsesdråbe, før opløsningen tørrer ud. Derefter anvende en coverslip ved at placere det lige over agarose pad og forsigtigt slippe det ned.Billede synaptiske regioner med en linje-scanning konfokal mikroskop koblet til en 488 og 552 nanometer optisk pumpet halvleder diode laser og udstyret med billedoptagelse software. Når du har lokaliseret ormene, skal du skifte til en 40X-forstørrelse og anvende nedsænkningsmediet. Visuel synaptic regionen ved spændende fluorophores med en 552 nanometer laser, 1% magt til tagRFP fluorophore, og 488 nanometer, 2% magt til GFP fluorophore.Tag billeder ved hjælp af en hybrid fotodetektor og sæt gevinster for at forhindre overeksponering af fluorophores. Saml Z-stack billeder til at dække hele synapsen ved hjælp af den optimale Z-trin størrelse afhængigt af målet. Hvis du vil analysere det synaptiske område, skal du begynde med at indlæse billederne i CellProfiler 3.1.5-softwaren.Konfigurer modulet NameAndType, og bestem den synaptiske område for hånd-definition ved hjælp af det diffuse tagRFP, der er udtrykt fra UIS-115-transgenet. Mål størrelsen og fluorescensen af den hånddefinerede synapse ved at tilføje modulerne MeasureObjectSizeShape og MeasureObjectIntensity til rørledningen. Den relative integrerede fluorescensintensitet beregnes derefter ved at tilføje CalculateMath-modulet og dividere de integrerede intensitetsenheder fra JSIS37 med enheder fra UIS-115.Når du er færdig eksportere alle målinger og beregninger. For at måle muskel celle område åbne billedet i Fiji software og bruge polygon udvælgelse til omhyggeligt at spore omkring en enkelt skrå muskel celle. Juster polygonens linje i slutningen ved at trække ankerppunktet for at forbedre sporingen.Gå til fanen Analysér øverst i softwaren, og klik på Mål for at beregne det markerede område. For muskelceller med et degenereret eller manglende område spores det manglende område med værktøjet til valg af polygon, og klik på Målér igen. Hvis der er flere huller, skal du spore hver enkelt separat.Beregn forholdet mellem mellemrumsområdet og arealet af hele cellen. Et højt forhold indikerer en højere grad af muskeldegeneration. Og hvis der ikke mangler regioner, beregnes forholdet som nul.Åbn Elastisk, og vælg Pixelklassifikation under Opret nyt projekt. Omdøb og gem derefter projektet. Gå til fanen inputdata, og klik på Tilføj ny, og tilføj derefter separate billeder.Direkte pop op-vinduet til mappen med TIF-filerne, og vælg det ønskede billede. Klik på Vælg funktioner under fanen Valg af funktion for at vælge alle pixelfunktioner, der er angivet med de grønne markerede felter. Pixelmarkering i dette trin bruges til at skelne mellem de forskellige klasser af pixel i næste trin.Brug et træningspanel til at skelne mellem de enkelte GFP-udtryk for myosinfilamenter og uønsket baggrund. Klik på Tilføj etiket og scrawl uønskede baggrunde og mellemrum mellem filamenter til at begynde klassificering uddannelse. Tilføj en anden etiket, omdøbe den til Filament, og scrawl over en række filamenter.Klik på Live Update for at sikre, at klassificeringen er udført korrekt. Hvis det er nødvendigt, skal du tilføje flere scrawls at finjustere uddannelsen. Når træningsklasseren er udført, skal du gå til panelet Forudsigelseseksport og klikke på Vælg Eksporter billedindstillinger med sandsynligheder som kilde.Sørg for, at udskæringsunderregionerne x og y er afkrydset, og c er ikke-afmærket. Vælg nul og én som start- og stopværdier for c, og Konverter datatype til usigneret 8-bit. Sæt kryds Renormalize og derefter ændre output fil video til png, omdøbe filen og mappen som ønsket.Luk vinduet Eksporter indstillinger, og eksportér det billede, der lige er blevet segmenteret. Åbn derefter png-filen i Fiji-software. Juster billedets tærskel ved hjælp af Standardindstillinger, og anvend plug-in'en for skeletonisering, som opretter en separat tabel med resultater.Denne protokol er blevet brugt til at udforske funktionen af alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17 i synapse udvikling. Kvantitativ analyse af billeder af den bageste/ laterale mikrotubule eller PLM synapser indikerer, at overekspression af MEC-17 forstyrrer normal neuron funktion. Sammenlignet med den vilde type kontrol dyr overexpressing MEC-17 har reduceret præsynaptiske regioner og synaptisk integritet.Disse teknikker er også blevet brugt til at analysere C.elegans modeller af Charcot-Marie-Tooth type 2 eller CMT2 regnskabsmæssige mutationer i CMT2-associerede gener. Visuel vurdering af kroppens vægmuskelmorfologi viste en 2,5 til 3,5 gange større forøgelse af defekter hos forsøgsdyrene sammenlignet med kontrol af vildtype. Dyr med mutationer i fzo-1 og unc-116 oplevet tab af muskeltriationer, ophobning af cellulære snavs, og muskelfiber degeneration.Mens dyr med mutationer i dyn-1 oplevede betydeligt færre defekter i muskelmorfologi. De fzo-1 og unc-116 mutanter viste en fem til seks gange stigning i forholdet mellem hul og samlede enkelt celle område og en dramatisk kortere gennemsnitlig fiberlængde i forhold til vilde type dyr. For at der kan foretages sammenligninger mellem prøverne, er det vigtigt at fastlægge de mest optimale betingelser for billederhvervelse og sikre, at disse betingelser anvendes konsekvent.Disse teknikker vil gøre det muligt for forskere at sammenligne morfologiske ændringer på tværs af forskellige genetiske baggrunde med kvantitative tilgange. Dette reducerer subjektiviteten og bidrager derfor til at forbedre repræsentereligheden af de genererede data.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualisering af Caenorhabditis elegans Cuticle strukturer ved hjælp af de lipofile Vital Dye, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Analysere og Building nukleinsyrestrukturer med 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Udvinding og Analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder til undersøgelse ændringer i iboende Protein sammenlægning med alder i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modellering Alders-associerede neurodegenerative sygdomme i Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...