Name: quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00
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Agradecemos a los miembros del laboratorio Neumann por sus valiosos debates y aportaciones. Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que es financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Los autores agradecen a WormBase por su gran cantidad de información sobre C. elegans,y reconocen a Monash Micro Imaging, de la Universidad de Monash, por el suministro de instrumentación, capacitación y soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por las becas de investigación CMTAA (2015 y 2018), y las Becas de Proyectos NHMRC 1101974 y 1099690 otorgadas a B.N.

1. Crecimiento y mantenimiento de las cepas de C. elegans
<ol><li>Medio de crecimiento de nematodos de semillas (NGM, ver Tabla de materiales) placas de agar con 300 l de la cepa de E. coli de crecimiento lento OP50 en un armario de flujo laminar.</li>
	<li>Deje las placas de agar NGM en el armario de flujo laminar para secar. NOTA: En ausencia de gabinete de flujo laminar, las placas se pueden dejar secar en el banco, pero son más propensas a la contaminación.</li>
	<li>Transfie...

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. , (1974).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. , (2017).</li><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+C.+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer's+disease+and+other+neurodegenerative+diseases.">Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Genetics. , (2014).</li><li>Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Proteins+Act+as+Transcriptional+Guarantors+to+Ensure+Terminal+Differentiation.">Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation.</a> Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).</li><li>Koushika, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Caenorhabditis+elegans+cytoplasmic+dynein+components+reveal+specificity+of+neuronal+retrograde+cargo.">Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo.</a> Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).</li><li>Byrne, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+dynamics+affects+behaviour+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li><li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+High-Resolution+Second-Harmonic+Generation+Imaging+of+Endogenous+Structural+Proteins+in+Biological+Tissues.">Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ilastik:+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit.">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+image+restoration+and+segmentation:+A+generalized+linear+model/bregman+perspective.">Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective.</a> International Journal of Computer Vision. , (2013).</li><li>Rizk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantification+of+subcellular+structures+in+fluorescence+microscopy+images+using+Squassh.">Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh.</a> Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).</li><li>Akella, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEC-17+is+an+alpha-tubulin+acetyltransferase.">MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase.</a> Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).</li><li>Neumann, B., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MEC-17+leads+to+microtubule+instability+and+axonal+degeneration.">Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration.</a> Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).</li><li>Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+alpha-tubulin+K40+acetyltransferase+alphaTAT1+promotes+rapid+ciliogenesis+and+efficient+mechanosensation.">The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).</li><li>Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maintenance+of+synaptic+structure+is+mediated+by+the+alpha-tubulin+acetyltransferase+MEC-17/&#945;TAT1.">Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/&#945;TAT1.</a> bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).</li><li>Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+mitofusin-2+in+health+and+disease.">Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease.</a> Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).</li><li>Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+genes+associated+with+Charcot-Marie-Tooth+type+2+lead+to+common+behavioural,+cellular+and+molecular+defects+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 605584 (2019).</li><li>Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+has+membrane+constricting+and+severing+abilities+sufficient+for+mitochondrial+and+peroxisomal+fission.">Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission.</a> Nature Communications. , (2018).</li><li>Zhu, P. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+Intermolecular+Domain+Interactions+of+the+C-terminal+GTPase+Effector+Domain+of+the+Multimeric+Dynamin-like+GTPase+Drp1.">Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).</li><li>Osellame, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+the+Drp1+adaptors+Mff,+MiD49+and+MiD51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission.</a> Journal of Cell Science. , (2016).</li><li>Dima, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+segmentation+algorithms+for+fluorescence+microscopy+images+of+cells.">Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells.</a> Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).</li><li>Trevisan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+Mitochondria+Dynamics+Reveals+Separate+Roles+for+Form+and+Function+in+Mitochondria+Distribution.">Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution.</a> Cell Reports. , (2018).</li></ol>

Con frecuencia se han evaluado variaciones morfológicas mediante el recuento manual de diferencias notables o mediante umbrales arbitrarios para determinar defectos en comparación con un fenotipo de tipo salvaje. Más recientemente, sin embargo, se han utilizado métodos cuantitativos para estudios comparativos de morfología para medir y describir con precisión los cambios a nivel celular y subcelular de manera imparcial. La capacidad de identificar diferencias sutiles pero biológicamente relevantes entre fenotipos ...

El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) se utiliza cada vez más como un sistema modelo para descubrir los procesos biológicos y moleculares involucrados en las enfermedades humanas. Un nematodo adulto tiene una longitud corporal de poco más de 1 mm, y puede producir una gran cría de hasta 300 huevos1. Después de la eclosión, C. elegans sólo requieren 3-4 días para llegar a la edad adulta, y vivir alrededor de 2 a 3 semanas2. Debido a su facilidad de cultivo, C. elegans es actualmente uno de los modelos animales in vivo más buscados para llevar a cabo pruebas de detección rápidas y rentables de medicamentos para identificar terapias para enfermedades humanas. Además, su conservación genética, paradigmas conductuales bien definidos, cuerpo transparente para fluorescencia o microscopía ligera, y facilidad de manipulación genética hacen que el estudio de las consecuencias celulares y moleculares de las mutaciones genéticas sea fácilmente alcanzable 3. El genoma de C. elegans comparte aproximadamente 60-80% de la ortología con genes humanos, y alrededor del 40% de esos genes se sabe que están relacionados con la enfermedad. Algunas de las enfermedades humanas que han sido modeladas y estudiadas en C. elegans incluyen trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth), enfermedades asociadas al músculo ( Distrofia muscular de Duchenne), y enfermedades metabólicas (hiperglucemia)2,4. En la mayoría de los trastornos humanos, se producen la localización celular y de los orgánulos inducida por la enfermedad y los cambios morfológicos, que pueden evaluarse fácilmente en el modelo de nematodos.
Los marcadores fluorescentes se han utilizado ampliamente para etiquetar tejidos y orgánulos para la visualización dinámica bajo el microscopio. Sin embargo, en C. elegans,los métodos convencionales que evalúan las irregularidades morfológicas debidas a mutaciones genéticas se han basado en gran medida en descripciones visuales. Si bien las evaluaciones cualitativas pueden abarcar rangos más amplios de descripciones fenotípicas (morfología sináptica, aglomeración gFP, forma axonal específica, grosor de la fibra muscular, etc.) y proporcionar una visión de pájaro de los cambios morfológicos, son menos adecuadas para comparando pequeñas variaciones entre diferentes grupos. Además, las evaluaciones cualitativas se basan en evaluaciones visuales y subjetivas, lo que puede dar lugar a sobreestimaciones o subestimaciones de anomalías morfológicas. Por último, las observaciones cualitativas también pueden variar mucho entre individuos, creando dificultades con la replicación de datos.
En los últimos años, se han desarrollado una serie de algoritmos computacionales fáciles de usar y fácilmente disponibles que pueden analizar cuantitativamente imágenes. Sin embargo, la utilización de este tipo de software de análisis de imágenes para algunos estudios morfológicos, especialmente en relación con los músculos de la pared del cuerpo y las mitocondrias, en C. elegans investigación se ha quedado atrás. Para mejorar el análisis estructural subyacente en C. elegans, se probaron algunos de los softwares de análisis de imágenes de código abierto fácilmente disponibles para comparar cuantitativamente los efectos de las mutaciones genéticas en las mitocondrias musculares, el músculo de la pared corporal y el sináptico Morfología. Estos procedimientos experimentales describen en detalle cómo estos programas (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) se pueden utilizar para evaluar los cambios en el tamaño sináptico y la localización de proteínas sinápticas, el área del músculo de la pared del cuerpo y la longitud de la fibra, y el tamaño mitocondrial y la circularidad como resultado de mutaciones genéticas en el nematodo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01614.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Inverted platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>Zeiss Axio Imager M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENCS22221GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1.5</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>Made by SCHOTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENS41104A/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KL 300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (Peptone from casein)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107213</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Peptone from meat)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107214</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105101</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106586</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS7095D5X-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430589-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>267201-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Met-app</td>
			<td>2616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9756-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans

Definir los mecanismos celulares subyacentes a la enfermedad es esencial para el desarrollo de nuevas terapias. Una estrategia que se utiliza con frecuencia para desentrañar estos mecanismos es introducir mutaciones en los genes candidatos y describir cualitativamente los cambios en la morfología de los tejidos y los orgánulos celulares. Sin embargo, las descripciones cualitativas pueden no capturar diferencias fenotípicas sutiles, pueden tergiversar variaciones fenotípicas entre individuos en una población y con frecuencia se evalúan subjetivamente. Aquí, se describen enfoques cuantitativos para estudiar la morfología de los tejidos y orgánulos en el nematodo Caenorhabditis elegans utilizando microscopía confocal de escaneo láser combinada con un software de procesamiento de bioimagen disponible comercialmente. Se realizó un análisis cuantitativo de fenotipos que afectan a la integridad de la sinapsis (tamaño y niveles de fluorescencia integrados), desarrollo muscular (tamaño de célula muscular y longitud del filamento de miosina) y morfología mitocondrial (circularidad y tamaño) para entender los efectos de las mutaciones genéticas en estas estructuras celulares. Estos enfoques cuantitativos no se limitan a las aplicaciones descritas aquí, ya que podrían utilizarse fácilmente para evaluar cuantitativamente la morfología de otros tejidos y orgánulos en el nematodo, así como en otros organismos modelo.

C. elegans es un organismo modelo ideal para estudiar la morfología de diferentes tejidos y orgánulos debido a su simplicidad, linaje celular conocido, transparencia y herramientas disponibles. Aquí, proporcionamos enfoques cuantitativos para el estudio de los orgánulos (por ejemplo, mitocondrias) y tejidos, incluyendo sinapsis y músculos utilizando imágenes de fluorescencia en vivo y software gratuito de procesamiento de bioimagen.
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Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman

Este estudio describe las mediciones cuantitativas del tamaño y localización sináptica, la morfología muscular y la forma mitocondrial en C. elegans utilizando herramientas de procesamiento de imágenes disponibles libremente. Este enfoque permite que estudios futuros en C. elegans comparen cuantitativamente la extensión de los cambios estructurales de tejidos y orgásis como resultado de mutaciones genéticas.

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

La capacidad de cuantificar los cambios en la morfología de los tejidos y orgánulos es importante para entender la función génica, así como el impacto de las mutaciones genéticas. Nuestros protocolos explican cómo el software de libre disposición se puede utilizar para evaluar no subjetivamente la morfología de las sinapsis, músculos y mitocondrias en un nematodo, C.elegans. Muchos estudios anteriores han confiado en métodos cualitativos para comparar los cambios morfológicos.Sin embargo, estos pueden ser problemáticos, ya que pueden no capturar diferencias fenotípicas sutiles, podrían sobrevalorar y subestimar los cambios, y se evalúan subjetivamente. Nuestros métodos cuantitativos proporcionan medios más robustos y menos sesgados para evaluar los cambios morfológicos. Estos métodos podrían utilizarse fácilmente para estudiar los cambios morfológicos en otras estructuras celulares u organismos modelo con el fin de definir la función génica y las consecuencias de las mutaciones asociadas a la enfermedad.Comience preparando diapositivas para imágenes. Coloque una gota de agarosa derretida en un portaobjetos del microscopio e presione inmediatamente hacia abajo la gota con otro portaobjetos del microscopio, aplanando suavemente la agarosa. Deje que la agarosa se seque durante un minuto y luego separe cuidadosamente las dos diapositivas y deje la almohadilla solidificada en una de las diapositivas.Coloque la diapositiva en la etapa del microscopio y agregue una gota de cinco a 10 mililitros de anestésico al centro de la almohadilla de agarosa. Utilice un pico esterilizado térmicamente para transferir rápidamente de 10 a 15 animales de la placa de almacenamiento a la gota anestésica antes de que la solución se seque. A continuación, aplique un cubreobjetos posicionándolo justo encima de la almohadilla de agarosa y desabrochando suavemente hacia abajo.Imagen de las regiones sinápticas con un microscopio confocal de escaneo de línea acoplado a un láser de diodo semiconductor de bomba óptica de 488 y 552 nanómetros y equipado con software de captura de imágenes. Después de localizar los gusanos, cambie a un aumento de 40X y aplique un medio de inmersión. Visualice la región sináptica excitando los fluoróforos con un láser de 552 nanómetros, 1% de potencia para el fluoróforo tagRFP y 488 nanómetros, 2% de potencia para el fluoróforo GFP.Captura imágenes usando un fotodetector híbrido y establece las ganancias para evitar la sobreexposición de los fluoróforos. Recoge imágenes de la pila Z para cubrir toda la sinapsis usando el tamaño óptimo del paso Z dependiendo del objetivo. Para analizar la región sináptica, comience cargando las imágenes en el software CellProfiler 3.1.5.Configure el módulo NameAndType y determine la región sináptica mediante la definición manual mediante el tagRFP difuso expresado desde el transgénido UIS-115. Mida el tamaño y la fluorescencia de la sinapsis definida a mano agregando los módulos MeasureObjectSizeShape y MeasureObjectIntensity a la canalización. A continuación, calcule la intensidad de fluorescencia integrada relativa añadiendo el módulo CalculateMath y dividiendo las unidades de intensidad integradas obtenidas de JSIS37 por las obtenidas de UIS-115.Cuando haya terminado, exporte todas las mediciones y cálculos. Para medir el área de la célula muscular abra la imagen en el software Fiji y utilice la selección de polígonos para trazar cuidadosamente alrededor de una sola célula muscular oblicua. Ajuste la línea del polígono al final arrastrando el punto de anclaje para mejorar el trazado.Vaya a la pestaña Analizar en la parte superior del software y haga clic en Medir para calcular el área seleccionada. Para las celdas musculares con una región degenerada o faltante, trace el área faltante con la herramienta de selección de polígonos y haga clic en Medir de nuevo. Si hay varios huecos, rastree cada uno por separado.Calcule la relación del área de separación con el área de toda la celda. Una proporción alta indica una mayor extensión de degeneración muscular. Y si no faltan regiones, la proporción se calcula como cero.Abra Elastic y elija Pixel Classification en Create New Project. A continuación, cambie el nombre y guarde el proyecto. Vaya a la pestaña de datos de entrada y haga clic en Agregar nuevo y, a continuación, en Agregar imágenes independientes.Dirija la ventana emergente a la carpeta con los archivos TIF y seleccione la imagen deseada. En la pestaña Selección de entidades, haga clic en Seleccionar entidades para seleccionar todas las entidades de píxel indicadas por las casillas marcadas en verde. La selección de píxeles de este paso se utiliza para distinguir las diferentes clases de píxeles en el paso siguiente.Utilice un panel de entrenamiento para distinguir entre los filamentos de miosina que expresan la GFP individuales y el fondo no deseado. Haga clic en Añadir etiqueta y garabatee fondos y espacios no deseados entre los filamentos para comenzar el entrenamiento del clasificador. Agregue una segunda etiqueta, cámbiele el nombre a Filamento y gareguee sobre un número de filamentos.Haga clic en Live Update para asegurarse de que la clasificación se ha realizado correctamente. Si es necesario, agregue más garabatos para afinar el entrenamiento. Una vez realizado el clasificador de entrenamiento, vaya al panel Exportación de predicción y haga clic en Elegir configuración de exportación de imagen con probabilidades como origen.Asegúrese de que las subregiones de recorte x e y están marcadas y c está desmarcada. Seleccione cero y uno como valores de inicio y detención para c y Convertir tipo de datos a 8 bits sin signo. Marque Renormalizar y, a continuación, cambie el vídeo del archivo de salida a png, cambiando el nombre del archivo y el directorio como desee.Cierre la ventana Configuración de exportación y exporte la imagen que acaba de segmentarse. A continuación, abra el archivo png en el software Fiji. Ajuste el umbral de la imagen mediante la configuración predeterminada y aplique el complemento de esqueleto, que creará una tabla de resultados independiente.Este protocolo se ha utilizado para explorar la función de la alfa-tubulina acetiltransferasa MEC-17 en el desarrollo de la sinapsis. El análisis cuantitativo de imágenes de microtúbulos posteriores/laterales o sinapsis PLM indica que la sobreexpresión de MEC-17 interrumpe la función normal de la neurona. En comparación con el tipo de silvestre animales que sobreexpresan MEC-17 han reducido significativamente las regiones presinápticas y la integridad sináptica.Estas técnicas también se han utilizado para analizar modelos C.elegans de Charcot-Marie-Tooth tipo 2 o CMT2 portadoras de mutaciones en genes asociados a CMT2. La evaluación visual de la morfología muscular de la pared corporal reveló un aumento de 2,5 a 3,5 veces los defectos en los animales de prueba en comparación con el control de tipo salvaje. Los animales con mutaciones en fzo-1 y unc-116 experimentaron pérdida de estrías musculares, acumulación de desechos celulares y degeneración de la fibra muscular.Mientras que los animales con mutaciones en dyn-1 experimentaron significativamente menos defectos en la morfología muscular. Los mutantes fzo-1 y unc-116 mostraron un aumento de cinco a seis veces en la relación entre la brecha y el área total de una sola célula y una longitud media de fibra dramáticamente más corta en comparación con los animales de tipo salvaje. Para realizar comparaciones entre muestras, es importante determinar las condiciones más óptimas para la adquisición de imágenes y asegurarse de que estas condiciones se utilizan de forma coherente.Estas técnicas permitirán a los investigadores comparar los cambios morfológicos en diferentes contextos genéticos con enfoques cuantitativos. Esto reduce la subjetividad y, por lo tanto, ayuda a mejorar la representabilidad de los datos generados.

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Biology

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Investigación

Biología

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
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Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

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La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

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Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

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Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

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