Name: quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Biz değerli tartışmalar ve giriş için Neumann Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bazı suşlar, NıH araştırma altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. Yazarlar C. eleganshakkında bilgi zenginliği Için wormbase teşekkür, ve Monash Micro Imaging kabul, Monash Üniversitesi, enstrümantasyon sağlanması için, eğitim ve teknik destek. Bu çalışma CMTAA araştırma hibe (2015 ve 2018) ve NHMRC proje hibe tarafından desteklenmektedir 1101974 ve 1099690 B.N. verildi

1. büyüme ve bakım C. elegans suşları
<ol><li>Tohum Nematode büyüme orta (NGM, bkz. malzeme tablosu) bir laminar akış kabininde yavaş büyüyen E. COLI gerinim OP50 μL 300 ile agar plakaları.</li>
	<li>NGM agar plakalarını laminar akış kabininde kurumaya bırakın. Not: laminar akış kabininin yokluğunda, plakalar bankta kurumaya bırakılabilirler, ancak kontaminasyona daha eğilimli olurlar.</li>
	<li>İki OP50-seeded NGM agar plakaları her biri için en az 20 ...

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. , (1974).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. , (2017).</li><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+C.+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer's+disease+and+other+neurodegenerative+diseases.">Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Genetics. , (2014).</li><li>Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Proteins+Act+as+Transcriptional+Guarantors+to+Ensure+Terminal+Differentiation.">Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation.</a> Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).</li><li>Koushika, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Caenorhabditis+elegans+cytoplasmic+dynein+components+reveal+specificity+of+neuronal+retrograde+cargo.">Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo.</a> Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).</li><li>Byrne, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+dynamics+affects+behaviour+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li><li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+High-Resolution+Second-Harmonic+Generation+Imaging+of+Endogenous+Structural+Proteins+in+Biological+Tissues.">Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ilastik:+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit.">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+image+restoration+and+segmentation:+A+generalized+linear+model/bregman+perspective.">Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective.</a> International Journal of Computer Vision. , (2013).</li><li>Rizk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantification+of+subcellular+structures+in+fluorescence+microscopy+images+using+Squassh.">Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh.</a> Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).</li><li>Akella, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEC-17+is+an+alpha-tubulin+acetyltransferase.">MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase.</a> Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).</li><li>Neumann, B., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MEC-17+leads+to+microtubule+instability+and+axonal+degeneration.">Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration.</a> Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).</li><li>Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+alpha-tubulin+K40+acetyltransferase+alphaTAT1+promotes+rapid+ciliogenesis+and+efficient+mechanosensation.">The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).</li><li>Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maintenance+of+synaptic+structure+is+mediated+by+the+alpha-tubulin+acetyltransferase+MEC-17/&#945;TAT1.">Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/&#945;TAT1.</a> bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).</li><li>Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+mitofusin-2+in+health+and+disease.">Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease.</a> Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).</li><li>Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+genes+associated+with+Charcot-Marie-Tooth+type+2+lead+to+common+behavioural,+cellular+and+molecular+defects+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 605584 (2019).</li><li>Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+has+membrane+constricting+and+severing+abilities+sufficient+for+mitochondrial+and+peroxisomal+fission.">Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission.</a> Nature Communications. , (2018).</li><li>Zhu, P. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+Intermolecular+Domain+Interactions+of+the+C-terminal+GTPase+Effector+Domain+of+the+Multimeric+Dynamin-like+GTPase+Drp1.">Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).</li><li>Osellame, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+the+Drp1+adaptors+Mff,+MiD49+and+MiD51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission.</a> Journal of Cell Science. , (2016).</li><li>Dima, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+segmentation+algorithms+for+fluorescence+microscopy+images+of+cells.">Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells.</a> Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).</li><li>Trevisan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+Mitochondria+Dynamics+Reveals+Separate+Roles+for+Form+and+Function+in+Mitochondria+Distribution.">Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution.</a> Cell Reports. , (2018).</li></ol>

Morfolojik varyasyonlar sıklıkla fark edilen farklılıklar el ile sayma veya vahşi tip fenotüre kıyasla kusurları belirlemek için rasgele eşikleri kullanarak değerlendirilir. Daha yakın zamanda, ancak, niceliksel Yöntemler, tarafsız bir şekilde hücresel ve subhücresel düzeyde değişiklikleri doğru ölçmek ve açıklamak için morfolojinin karşılaştırmalı çalışmaları için kullanılmıştır. Fenotürleri arasında ince henüz biyolojik olarak alakalı farklar tanımlamak için yeteneği çevr...

Nematod Caenorhabditis elegans (C. elegans) , insan hastalığında yer alan biyolojik ve moleküler süreçleri ortaya çıkarmak için giderek bir model sistemi olarak kullanılmaktadır. Bir yetişkin nematod sadece 1 mm üzerinde bir vücut uzunluğu vardır ve 300 yumurta1kadar büyük bir damızlık üretebilir. Hatching sonra, C. elegans sadece yetişkin ulaşmak için 3-4 gün gerektirir ve yaklaşık 2 ila 3 hafta2için yaşamak. Kültür kolaylığı nedeniyle, C. elegans Şu anda insan hastalıkları için terapötik tanımlamak için maliyet-etkili, hızlı ilaç taraması yapmak için en çok aranan in vivo hayvan modellerinin biridir. Ayrıca, genetik koruma, iyi tanımlanmış davranışsal paradigmalar, floresan veya ışık mikroskobu için şeffaf vücut, ve genetik manipülasyon kolaylığı genetik mutasyonların hücresel ve moleküler sonuçlarının çalışma kolayca ulaşılabilir hale 3. C. elegans genom hisselerin yaklaşık% 60-80 insan genleri ile ortoloji ve bu genlerin yaklaşık% 40 ' i hastalık ile ilgili olduğu bilinmektedir. C. elegans modellenmiş ve okudu bazı insan hastalıkları nörodejeneratif bozukluklar (Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amilotrofik lateral skleroz, Charcot-Marie-Tooth hastalığı), kas ilişkili hastalıklar ( Duchenne kas Distrofi) ve metabolik hastalıklar (hiperglisemi)2,4. Çoğu insan bozukluklarında, hastalığın kaynaklı hücresel ve organel lokalizasyonu ve morfolojik değişiklikler ortaya çıkar ve bu da Nematot modelinde kolayca değerlendirilebilecek.
Floresan işaretçileri mikroskopla dinamik görselleştirme için dokulara ve organelleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, C. elegans, genetik mutasyonlar nedeniyle morfolojik düzensizlikleri değerlendirmek konvansiyonel yöntemler büyük ölçüde görsel açıklamaları üzerinde dayanmış. Nitel değerlendirmeler fenokolojik açıklamaların daha geniş aralıklarını (sinaptik morfoloji, Gfp kümelenme, spesifik akal şekli, kas lif kalınlığı, vb.) kapsayacak ve morfolojik değişikliklerin bir kuş bakışı görünümü sağlamak, onlar için daha az uygundur farklı gruplar arasında küçük varyasyonları karşılaştırarak. Ayrıca, niteliksel değerlendirmeler, morfolojik anomalilerin üzerinde veya daha fazla tahminine yol açabilecek görsel, subjektif değerlendirmeye dayanır. Son olarak, nitel gözlemler de bireyler arasında büyük farklılık gösterebilir, veri çoğaltma ile zorluklar yaratmak.
Son yıllarda, görüntüleri nicel olarak analiz edebilir Kullanıcı dostu, kolayca kullanılabilir Hesaplamalı algoritmalar bir dizi geliştirilmiştir. Ancak, bazı morfolojik çalışmalar için bu tür görüntü analiz yazılımının kullanımı, özellikle vücut duvar kasları ve mitokondri ile ilgili olarak, C. elegans araştırma arkasında gecikmiştir. C. eleganstemel yapısal analiz geliştirmek için, bazı hazır, açık kaynak görüntü analiz yazılımı niceliksel kas mitokondri üzerinde genetik mutasyonların etkilerini karşılaştırmak için trialed edildi, vücut duvar kas ve sinaptik Morfolojisi. Bu deneysel prosedürler ayrıntılı olarak nasıl bu programların (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) sinaptik boyutu ve sinaptik protein lokalizasyonu, vücut duvar kas alanı ve lif uzunluğu ve mitokondriyal boyutu değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir anahat ve Nematot genetik mutasyonlar sonucu olarak döngü.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01614.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Inverted platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>Zeiss Axio Imager M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENCS22221GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1.5</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>Made by SCHOTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENS41104A/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KL 300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (Peptone from casein)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107213</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Peptone from meat)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107214</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105101</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106586</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS7095D5X-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430589-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>267201-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Met-app</td>
			<td>2616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9756-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans

Hastalığın altta yatan hücresel mekanizmaların tanımlanması, yeni teraplerin geliştirilmesi için önemlidir. Bu mekanizmaları çözmek için sık kullanılan bir strateji, aday genlerde mutasyonları tanıtmak ve dokuların ve hücresel organizlerin morfolojisindeki değişiklikleri niteliksel olarak tarif etmektir. Ancak, nitel açıklamaları ince fenosimik farklar yakalamayabilir, bir nüfusun bireyler arasında fenotipi varyasyonları yanlış gösterebilir, ve sıklıkla subjektif olarak değerlendirilir. Burada, nicel yaklaşımlar nematod Caenorhabditis elegans içinde dokuların ve organelilerin morfolojisi, ticari olarak mevcut biyo-görüntü işleme yazılımı ile birlikte lazer tarama konfetit mikroskopisi kullanarak incelemek için açıklanmıştır. Sinaps bütünlüğünü (boyut ve entegre floresan seviyeleri) etkileyen fenotiplerin nicel analizi, kas gelişimi (kas hücresi boyutu ve miyosin filament uzunluğu), ve mitokondriyal morfoloji (devre ve boyutu) anlamak için yapıldı Bu hücresel yapılarda genetik mutasyonların etkileri. Bu niceliksel yaklaşımlar, burada açıklanan uygulamalarla sınırlı değildir, çünkü Nematot 'taki diğer dokuların ve organelların morfolojisini ve diğer model organizmalardaki gibi kolayca nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir.

C. elegans basitliği, bilinen hücre sırtı, şeffaflık ve mevcut araçlar nedeniyle farklı dokuların ve organellerin morfolojisi okumak için ideal bir model organizmadır. Burada, canlı floresan görüntüleme ve ücretsiz biyo-görüntü işleme yazılımı kullanarak sinaps ve kaslar dahil olmak üzere organeliler (örneğin mitokondri) ve dokularda eğitim için nicel yaklaşımlar sağlıyoruz.
Norma...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Doku ve organellerin morfolojisindeki değişiklikleri ölçebilme yeteneği gen işlevinin anlaşılması nda ve genetik mutasyonların etkisinde önemlidir. Protokollerimiz, nematod, C.elegans'ta sinapsların, kasların ve mitokondrinin morfolojisinin subjektif olmayan bir şekilde değerlendirilmesi için serbestçe kullanılabilen yazılımların nasıl kullanılabileceğini açıklanmaktadır. Daha önceki birçok çalışma morfolojik değişiklikleri karşılaştırmak için nitel yöntemlere dayanıyordu.Ancak, bunlar ince phenotik farklılıkları yakalayamadıkları, değişiklikleri tekrar ve hafife alabilecekleri ve öznel olarak değerlendirildikleri için sorunlu olabilir. Kantitatif yöntemlerimiz morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için daha sağlam ve daha az önyargılı araçlar sağlar. Bu yöntemler, gen fonksiyonunu ve hastalıkla ilişkili mutasyonların sonuçlarını tanımlamak için diğer hücresel yapılardaki veya model organizmalardaki morfolojik değişimleri incelemek için kolayca kullanılabilir.Görüntüleme için slaytlar hazırlayarak başlayın. Bir mikroskop slayt üzerine erimiş agarose bir damla yerleştirin ve hemen yavaşça agarose düzleştirmek, başka bir mikroskop slayt ile damlacık aşağı basın. Agarose'u bir dakika kurumaya bırakın sonra iki kaydırağı dikkatlice ayırın ve katılaşmış pedi slaytlardan birine bırakın.Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve agarose pedin ortasına beş ila 10 mililitrelik bir anestezi damlası ekleyin. Çözelti kurumadan önce stok plakasından anestezik damlacıklara 10 ila 15 hayvanı hızlı bir şekilde aktarmak için ısı yalıtımlı bir kazma kullanın. Sonra agarose ped hemen üzerinde konumlandırma ve yavaşça aşağı bırakarak bir coverslip uygulayın.488 ve 552 nanometre optik pompalı yarı iletken diyot lazer ile birleştiğinde ve görüntü yakalama yazılımı ile donatılmış bir çizgi tarama konfokal mikroskop ile sinaptik bölgeleri görüntüleyin. Solucanları buladıktan sonra 40X büyütmeye geçin ve daldırma ortamı uygulayın. 552 nanometre lazer, tagRFP florofor için % 1 güç ve 488 nanometre, GFP florofor için % 2 güç ile florofororları heyecanlandırarak sinaptik bölgeyi görselleştirin.Hibrit fotodedektör kullanarak görüntüleri yakalayın ve floroforların aşırı maruz kalmasını önlemek için kazanımları ayarlayın. Hedefe bağlı olarak en uygun Z adımı boyutunu kullanarak tüm sinapskapsayacak şekilde Z-yığın görüntüleri toplayın. Sinaptik bölgeyi analiz etmek için görüntüleri CellProfiler 3.1.5 yazılımına yükleyerek başlayın.NameAndType modüllerini ayarlayın ve UIS-115 transgeninden ifade edilen diffüz tagRFP'yi kullanarak sinaptik bölgeyi el tanımıyla belirleyin. El tanımlı sinapsın boyutunu ve floresanını, pipeline'a MeasureObjectSizeShape ve MeasureObjectIntensity modüllerini ekleyerek ölçün. Daha sonra CalculateMath modüllerini ekleyerek ve JSIS37'den elde edilen entegre yoğunluk birimlerini UIS-115'ten elde edilenlerle bölerek göreli entegre floresan yoğunluğunu hesaplayın.Bittiğinde tüm ölçümler ve hesaplamalar ihracat. Kas hücre alanını ölçmek için Fiji yazılımında görüntüyü açın ve tek bir eğik kas hücresi etrafında dikkatle izlemek için çokgen seçimini kullanın. İzlemeyi geliştirmek için çapa noktasını sürükleyerek sonundaki çokgenin çizgisini ayarlayın.Yazılımın üst kısmındaki Analiz sekmesine gidin ve seçili alanı hesaplamak için Ölçü'ye tıklayın. Dejenere veya eksik bölge olan kas hücreleri için çokgen seçim aracıyla eksik alanı takip edin ve tekrar Ölçüle'yi tıklatın. Birden çok boşluk varsa, her birini ayrı ayrı izle.Boşluk alanının tüm hücrenin alanına oranını hesaplayın. Yüksek bir oran kas dejenerasyonu daha yüksek ölçüde gösterir. Eksik bölge yoksa, oran sıfır olarak hesaplanır.Elastik'i açın ve Yeni Proje Oluştur altında Piksel Sınıflandırması'nı seçin. Sonra yeniden adlandırın ve projeyi kaydedin. Giriş veri sekmesine gidin ve Yeni Ekle'yi tıklatın ve sonra ayrı görüntüler ekleyin.'e gidin.Açılır pencereyi TIF dosyalarıyla klasöre yönlendirin ve istediğiniz görüntüyü seçin. Özellik Seçimi sekmesinde, yeşil işaretli kutulartarafından belirtilen tüm piksel özelliklerini seçmek için Özellikleri Seç'e tıklayın. Bu adımdaki piksel seçimi, bir sonraki adımda farklı piksel sınıflarını ayırt etmek için kullanılır.Bireysel GFP ifade miyozin filamentler ve istenmeyen arka plan ayırt etmek için bir Eğitim paneli kullanın. Sınıflayıcı eğitimine başlamak için Etiket Ekle'ye tıklayın ve filamentler arasındaki istenmeyen arka planlar ve boşluklar karalayın. İkinci bir etiket ekleyin, Filament'e yeniden adlandırın ve bir dizi filamentin üzerine karalayın.Sınıflandırmanın doğru yapıldığından emin olmak için Canlı Güncelleştirme'yi tıklatın. Gerekirse, eğitimi ince ayaryapmak için daha fazla karalama ekleyin. Eğitim sınıflandırıcısı yapıldıktan sonra, Tahmin Dışa Aktar paneline gidin ve kaynak olarak olasılıkları olan Dışa Aktar Görüntü Ayarlarını Seçin'i tıklatın.X ve y alt bölgelerinin işaretli olduğundan ve c'nin işaretsiz olduğundan emin olun. C için başlangıç ve durdurma değerleri olarak sıfır ve bir'i seçin ve Veri Türünü imzasız 8 bit'e dönüştürün. Yeniden normalleştir'i işaretleyin ve çıktı dosyası videosunu png olarak değiştirin ve dosyayı ve dizini istediğiniz gibi yeniden adlandırın.Dışa Aktarma ayarları penceresini kapatın ve yeni bölümlenmiş görüntüyü dışa aktarın. Sonra Fiji yazılımıpng dosyasını açın. Varsayılan ayarları kullanarak görüntünün eşiğini ayarlayın ve ayrı bir sonuç tablosu oluşturacak olan iskeletleştirme eklentisini uygulayın.Bu protokol sinaps gelişiminde alfa-tubulin asetiltransferaz MEC-17 işlevini keşfetmek için kullanılmıştır. Posterior/lateral mikrotübül veya PLM sinapslarının görüntülerinin nicel analizi, MEC-17'nin aşırı ekspresyonunun normal nöron fonksiyonunu bozduğunu göstermektedir. MEC-17'yi aşırı ifade eden yabani tip kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında presinaptik bölgeler ve sinaptik bütünlüğü önemli ölçüde azaltmıştır.Bu teknikler ayrıca CMT2 ilişkili genlerde mutasyon taşıyan Charcot-Marie-Tooth tip 2 veya CMT2'nin C.elegans modellerini analiz etmek için de kullanılmıştır. Vücut duvarı kas morfolojisinin görsel değerlendirmesi, test hayvanlarındaki defektlerde yabani tip kontrolüne göre 2,5 ila 3,5 kat artış saptandı. Fzo-1 ve UNC-116 mutasyonları olan hayvanlar kas striations kaybı deneyimli, hücresel enkaz birikimi, ve kas lif dejenerasyonu.Dyn-1 mutasyonu olan hayvanlar kas morfolojisinde önemli ölçüde daha az kusur yaşarken. Fzo-1 ve unc-116 mutantları, toplam tek hücreli alana boşluk oranında beş ila altı kat artış ve vahşi tip hayvanlara göre önemli ölçüde daha kısa bir ortalama lif uzunluğu gösterdi. Örnekler arasında karşılaştırmalar yapılabilmesi için en uygun şartları belirlemek ve bu şartların sürekli olarak kullanılımından emin olmak üçeBu teknikler, araştırmacıların farklı genetik geçmişler arasındaki morfolojik değişiklikleri nicel yaklaşımlarla karşılaştırmalarına olanak sağlayacaktır. Bu öznellik azaltır ve bu nedenle oluşturulan verilerin temsil edilebilirliğini artırmak için yardımcı olur.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...