Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Forfatterne anerkender finansiering fra NIAID/NIH (1R01AI137075-01), Carver Trust medicinsk forskningsinitiativ Grant, og University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Protokollen blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og anvendelse udvalg af University of Iowa.
1. fækal prøveindsamling og håndtering
<ol><li>Steriliser skille kasserne (Se tabel over materialer, supplerende figur 1) med 70% ethanol.</li>
	<li>Foretikettens mikrocentrifuge glas (én pr. mus) med prøve-ID og behandlingsgruppe (hvis relevant).</li>
	<li>Placer musene i steriliserede skille kasser, og lad dem defecere normalt i op til 1 time.</li>
	...

Den beskrevne protokol er enkel, med nemme at følge trin til at udføre mikrobiome profilering ved hjælp af 16S rRNA metagenomanalyse sekvensering fra et stort antal bioeksemplarer af interesse. Næste generations sekvensering har forvandlet mikrobielle økologi studier, især i humane og prækliniske sygdomsmodeller31,32. Den største fordel ved denne teknik er dens evne til med succes at analysere komplekse mikrobielle kompositioner (culturable og ikke-cultur...

Microbiota refererer til en samling af mikroorganismer (bakterier, vira, archaea, Bakteriofager og svampe), der lever i et bestemt miljø, og mikrobiomet refererer til det kollektive genom af residente mikroorganismer. Da bakterier er en af de mest udbredte mikrober i mennesker og mus, er denne undersøgelse kun fokuseret på bakteriel profilering. Den menneskelige tarm er koloniseret af trillioner af bakterier og hundredvis af bakteriestammer1. Den normale Gut mikrobiota spiller en afgørende rolle i at opretholde en sund tilstand i værten ved at regulere funktioner (dvs. vedligeholdelse af en intakt tarm barriere, føde stof metabolisme, energi homøostase, hæmning af kolonisering af patogene organismer, og regulering af immunrespons)2,3,4,5. Kompositoriske forstyrrelser af tarmen mikrobiota (Gut dysbiosis) har været forbundet med en række sygdomme hos mennesker, herunder gastrointestinale lidelser6, fedme7,8, slagtilfælde9, kræft10, diabetes8,11, reumatoid arthritis12, allergi13, og centrale nervesystem-relaterede sygdomme som multipel sklerose (MS)14,15 og Alzheimers sygdom (ad)8,16. Derfor har der i de senere år været stigende interesse for værktøjer til identificering af bakterie sammensætning på forskellige krops steder. En pålidelig metode bør have egenskaber såsom at være høj gennemløb og nem at bruge, der har evnen til at klassificere bakteriel mikrobiota med høj opløsning, og er lave omkostninger.
Kulturbaserede mikrobiologiske teknikker er ikke følsomme nok til at identificere og karakterisere den komplekse tarm mikrobiom på grund af svigt af flere tarm bakterier til at vokse i kulturen. Fremkomsten af den Sequencing-baserede teknologi, især 16S rRNA-baserede metagenomanalyse Sequencing, har overvundet nogle af disse udfordringer og omdannet mikrobiome forskning17. Advanced 16S rRNA-baseret sekvente Rings teknologi har hjulpet med at etablere en kritisk rolle for tarm mikrobiomet i menneskers sundhed. Det humane Mikrobiome-projekt, et nationalt Institut for sundhedsinitiativ18, og MetaHIT-projektet (et europæisk initiativ)19 har begge medvirket til at etablere en grundlæggende ramme for mikrobiomome analyse. Disse initiativer bidrog til at kickstarte flere undersøgelser for at bestemme den rolle, som tarm mikrobiomet spiller for menneskers sundhed og sygdom.
En række grupper har vist Gut dysbiosis hos patienter med inflammatoriske sygdomme12,14,15,20,21,22. Selv om det er almindeligt anvendt til taksonomisk profilering på grund af evnen til at multiplex og lave omkostninger, er der ingen ensartede protokoller for 16S rRNA-baseret taksonomisk profilering. En anden begrænsning er den lave opløsning af taksonomisk tildeling på grund af mindre sekvensering af læsninger (150 BP eller 250 BP) og brug af kun fremad sekvensering læst (R1) på grund af lav kvalitet reverse sekventering læser (R2). Men, fremskridt i sekvensering teknologi har bidraget til at overvinde nogle af disse udfordringer, såsom evnen til at sekvens længere læser ved hjælp af parret-end læser (f. eks Illumina MiSeq 2x300bp).
Den nuværende sekvensering teknologi kan sekvens 600 BP god kvalitet læser, som tillader sammenlægning af R1 og R2 læser. Disse fusionerede længere R1 og R2 læser giver bedre taksonomiske tildelinger, især med åben adgang R-baseret divisive Amplicon denoising algoritme-2 (DADA2) platform. DADA2 bruger amplikonen Sequence variant (ASV)-baserede tildelinger i stedet for operationelle taksonomiske Unit (otu)-tildelinger baseret på 97% lighed udnyttet af qiime23. ASV kampe resulterer i en nøjagtig sekvens match i databasen inden for 1 – 2 nucleotider, hvilket fører til tildeling på slægten og Arts niveauer. Kombinationen af længere, kvalitetsmæssige og bedre taksonomiske tildelings værktøjer (som f. eks. DADA2) har således forvandlet mikrobiome studier.
Forudsat her er en trin-for-trin guide til udførelse af bakteriel profilering ved hjælp af to-trins forstærkning af v3-v4-regionen 16S rRNA og dataanalyse ved hjælp af DADA2, Phyloseq og METAGENassist pipelines. Til denne undersøgelse anvendes humane leukocytantigen (HLA) klasse II-Transgene mus, da visse HLA klasse II-alleler er forbundet med en disposition for autoimmune sygdomme som MS20,24,25. Men, betydningen af HLA klasse II gener i reguleringen af sammensætningen af Gut mikrobiota er ukendt. Det er en hypotese, at HLA klasse II molekyle vil påvirke Gut mikrobielle samfund ved at vælge for specifikke bakterier. Major komplekse Complex (MHC) klasse II Knockout-mus (AE. ko) eller mus, der udtrykker humane HLA-DQ8-molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 blev anvendt for at forstå betydningen af HLA-klasse II-molekyler i forme tarm mikrobielle samfund. Det menes, at denne komplette og forenklede arbejdsgang med R-baseret dataanalyse vil tjene som et glimrende redskab for forskere, der er interesseret i at udføre mikrobiome profilering undersøgelser.
Generation af mus mangler endogene murine MHC klasse II gener (AE. KO) og AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) Transgene mus med en C57BL/6J baggrund er blevet beskrevet tidligere26. Fækale prøver opsamles fra mus af begge køn (8 – 12 ugers alderen). Mus blev tidligere opdrættet og vedligeholdt i University of Iowa Animal facilitet som pr NIH og institutionelle retningslinjer. Forurenings bekæmpelses strategier såsom fravænning af musene inde i et laminar flow kabinet, udskiftning af handsker mellem forskellige stammer af mus og korrekt vedligeholdelse af mus er kritiske trin til profilering af Gut-mikrobiome.
Korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) anbefales stærkt under hele proceduren. Passende negative kontroller bør medtages, når der udføres DNA-isolation, PCR1 og PCR2 forstærkning, og sekvensering trin. Brug af sterile, DNase-fri, RNase-fri og pyrogen-fri forsyninger anbefales. Der skal anvendes en udpeget pipette til mikrobiome arbejde og filtrerede pipettespidser i hele protokollen. Mikrobiota analyse består af syv trin: 1) fækal prøveindsamling og behandling; 2) udvinding af DNA; 3) 16S rRNA-genamplifikation; 4) DNA-Biblioteks konstruktion ved hjælp af indekseret PCR; 5) oprydning og kvantificering af indekseret PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; og 7) databehandling og Sekvensanalyse. Der vises et skematisk diagram over alle protokol trin i figur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

Den menneskelige tarm er koloniseret af billioner af bakterier, der understøtter fysiologiske funktioner såsom fødevare metabolisme, energi høst, og regulering af immunsystemet. Perturbation af den sunde tarm mikrobiom er blevet foreslået at spille en rolle i udviklingen af inflammatoriske sygdomme, herunder multipel sklerose (MS). Miljømæssige og genetiske faktorer kan påvirke sammensætningen af mikrobiomet Derfor er identifikation af mikrobielle samfund, der er forbundet med en sygdoms fænotype, blevet det første skridt i retning af at definere mikrobiomes rolle i sundhed og sygdom. Brug af 16S rRNA metagenomanalyse sekventering for profilering bakteriel samfund har bidraget til at fremme mikrobiome forskning. På trods af sin brede anvendelse, er der ingen ensartet protokol for 16S rRNA-baseret taksonomisk profilering analyse. En anden begrænsning er den lave opløsning af taksonomisk tildeling på grund af tekniske vanskeligheder såsom mindre sekvensering læser, samt brug af kun Forward (R1) læser i den endelige analyse på grund af lav kvalitet af reverse (R2) læser. Der er behov for en forenklet metode med høj opløsning til at karakterisere bakteriel mangfoldighed i en given biopræparat. Fremskridt i sekvensering teknologi med evnen til at sekvens længere læser ved høj opløsning har bidraget til at overvinde nogle af disse udfordringer. Den nuværende sekvenserings teknologi kombineret med en offentligt tilgængelig metagenomisk analyse pipeline såsom R-baseret divisive Amplicon denoising algoritme-2 (DADA2) har medvirket til at fremme mikrobiel profilering ved høj opløsning, da DADA2 kan tildele sekvens på slægten og Arts niveauer. Beskrevet her er en guide til at udføre bakteriel profilering ved hjælp af to-trins forstærkning af v3-v4-regionen i 16S rRNA-genet, efterfulgt af analyse ved hjælp af frit tilgængelige analyseværktøjer (dvs. DADA2, Phyloseq og METAGENassist). Det menes, at denne enkle og komplette workflow vil tjene som et glimrende værktøj for forskere interesseret i at udføre mikrobiome profilering undersøgelser.

Da MHC klasse II molekyler (HLA hos mennesker) er centrale aktører i den adaptive immunrespons og vise stærke foreninger med en disposition til MS24,25,26, det var en hypotese, at HLA klasse II molekyle påvirke tarm mikrobiel sammensætning. Derfor blev mus, der manglede MHC klasse II-genet (AE. KO) eller udtrykker humant HLA-DQ8-gen (HLA-DQ8) udnyttet til at forstå betydningen af HLA-klasse II-molekyler i udformningen af Gu...

Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Beskrevet her er en forenklet standard betjeningsprocedure for mikrobiome profilering ved hjælp af 16S rRNA metagenomanalyse sekvensering og analyse ved hjælp af frit tilgængelige værktøjer. Denne protokol vil hjælpe forskere, som er nye inden for mikrobiom-området, samt dem, der kræver opdateringer om metoder til at opnå bakteriel profilering ved en højere opløsning.

Mikrobiota-analyse ved hjælp af to-trins PCR og næste generations 16S rRNA-Gensekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Profilering af mikrobiom er det første skridt i retning af at definere den rolle, mikrobiom i sundhed og sygdom. Her beskriver vi en enkel procedure for isolering af bakterielt DNA af høj kvalitet fra fækal prøve, der forbereder bibliotek, udfører 16SR RNA og en metagenomisk sekventering og mikrobiomdataanalyse. Denne protokol vil hjælpe forskere nye til mikrobiom felt, samt forskere, der arbejder i mikrobiom område i oprettelse af mikrobiom rørledningen i deres laboratorium. Denne protokol kan udvides til profilering af mikrobiom fra andre bio prøver såsom nasal, oral, eller hudprøver af dyr og mennesker. Perleplukning er de vigtigste trin, da alle downstream-trin afhænger af DNA af høj kvalitet. Korrekt forsegling af konserveringspladen er vigtig, da ufuldstændig forsegling kan føre til undertrykkelse af forstærket produkt, hvilket resulterer i sekvensdata af lav kvalitet. Til at begynde, sterilisere divider kasser med 70% ethanol. Placer musene i steriliserede skillekasser og lad dem defecate normalt i op til en time. Brug sterile kraftbefængte til at opsamle fækale pellets i et tomt formærket mikrocentrifugerør med forhænde. Vedlægge røret sikkert. Steriliser snåleglasset med 70% ethanol, efterfulgt af en bakterienedlig engangsslet, efter indsamling af fækal fra hver mus. Afvejes 200 milligram fækale pellets i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør med 0,1 milliliterglasperler, og perlerøret anbringes i en perle, der slår homogenisator, og homogenisere prøverne i 45 sekunder ved stuetemperatur med en hastighed på 4,5 meter i sekundet. Uddrag DNA i henhold til instruktioner fra kit producenten og elute DNA i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør. Efter isolering af DNA kvantificeres det isolerede DNA ved at indlæse 1 mikroliter af DNA'et på et fluorometer. Opsætning 16S ribosomal RNA-genforstærkning PCR1 i en 96-Well PCR-plade ved hjælp af en 25 mikroliters reaktionsvolumen. Ved hjælp af en multi-kanal pipette, tilsættes 40 nano gram DNA, 13,5 mikro liter 2X high-fidelity polymerase enzym mix, der indeholder buffer, plus DNTPs i frem og tilbage primer. Luk PCR-pladen korrekt fra toppen til bunden ind langs alle fire kanter. Og centrifuge på 1000 gange G ved 20

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Næste generations sekventering af 16S ribosomalt RNA Gene Amplikoner

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Målrettet DNA methyleringsanalyse by Next generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forstærkning, Næste generations sekventering, og Genomisk DNA Kortlægning af retroviral integration steder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effektiv Nucleic Acid Udvinding og 16S rRNA Gene sekventering for bakteriel Community karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Guidede protokol for fækal mikrobielle karakterisering af 16S rRNA-amplikon sekventering

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: En protokol til Domainome bibliotek konstruktion, validering og udvælgelse af Phage Display og næste Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Kryds Microbiome karakterisering af næste generations 16S rRNA-amplikon sekventering

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

To-trins omvendt transkriptionsdråbe digitale PCR-protokoller til SARS-CoV-2-detektion og kvantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

En magnetisk perle-baseret Mosquito DNA ekstraktion protokol for næste generations sekventering

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...