Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

De auteurs erkennen de financiering van de NIAID/NIH (1R01AI137075-01), de Carver Trust Medical Research Initiative Grant, en het University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Het protocol werd goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Iowa.
1. fecale Monsterverzameling en-behandeling
<ol><li>Steriliseer de scheidings boxen (Zie tabel van de materialen, aanvullend figuur 1) met 70% ethanol.</li>
	<li>Pre-label microcentrifuge buizen (één per muis) met de monster-ID en de behandelingsgroep (indien van toepassing).</li>
	<li>Plaats de muizen in gesteriliseerde scheidings boxen en la...

Het beschreven protocol is eenvoudig, met gemakkelijk te volgen stappen voor het uitvoeren van microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing van een groot aantal biospecimens van belang. De volgende generatie sequencing heeft microbiële ecologie studies getransformeerd, vooral in humane en preklinische ziekte modellen31,32. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om complexe microbiële composities (culturable en n...

Microbiota verwijst naar een verzameling van micro-organismen (bacteriën, virussen, Archaea, bacteriofagen en schimmels) die in een bepaalde omgeving leven, en de microbiome verwijst naar het collectieve genoom van ingezeten micro-organismen. Aangezien bacteriën een van de meest voorkomende microben bij mensen en muizen zijn, is deze studie alleen gericht op bacteriële profilering. De menselijke darm wordt gekoloniseerd door triljoenen bacteriën en honderden bacteriële stammen1. De normale gut microbiota speelt een vitale rol bij het handhaven van een gezonde staat in de gastheer door het reguleren van functies (dat wil zeggen, onderhoud van een intacte intestinale barrière, voedsel metabolisme, energie homeostase, remming van de kolonisatie door pathogene organismen, en regulering van de immuunresponsen)2,3,4,5. Compositorische perturbaties van de darm microbiota (gut dysbiosis) zijn gekoppeld aan een aantal menselijke ziekten, met inbegrip van gastro-intestinale stoornissen6, obesitas7,8, beroerte9, Cancer10, diabetes8,11, reumatoïde artritis12, allergieën13, en het centrale zenuwstelsel-gerelateerde ziekten zoals multiple sclerose (MS)14,15 en de ziekte van Alzheimer ziekte (AD)8,16. Daarom, in de afgelopen jaren, is er groeiende belangstelling voor instrumenten voor het identificeren van bacteriële samenstelling op verschillende lichaam sites. Een betrouwbare methode moet kenmerken hebben zoals hoge doorvoer en eenvoudig te gebruiken, met de mogelijkheid om bacteriële microbiota met hoge resolutie te classificeren, en lage kosten.
Op cultuur gebaseerde microbiologische technieken zijn niet gevoelig genoeg om het complexe darmmicrobioom te identificeren en karakteriseren als gevolg van het falen van verschillende darmbacteriën om in cultuur te groeien. De opkomst van de sequencing-gebaseerde technologie, met name 16S rRNA gebaseerde metagenomische sequencing, heeft een aantal van deze uitdagingen overwonnen en getransformeerd microbiome onderzoek17. Geavanceerde 16S rRNA-gebaseerde sequentie technologie heeft geholpen bij het vaststellen van een cruciale rol voor het microbioom van de darmen in de menselijke gezondheid. Het humane Microbiome project, een National Institutes of Health Initiative18, en het metahit project (een Europees initiatief)19 hebben beiden geholpen bij het opzetten van een basiskader voor Microbiome analyse. Deze initiatieven hielpen een kick-start van meerdere studies om de rol van het microbioom van de darmen in de menselijke gezondheid en ziekte te bepalen.
Een aantal groepen hebben aangetoond gut dysbiosis bij patiënten met ontstekingsziekten12,14,15,20,21,22. Ondanks dat het op grote schaal wordt gebruikt voor taxonomische profilering vanwege het vermogen tot multiplex en lage kosten, zijn er geen uniforme protocollen voor 16S rRNA-gebaseerde taxonomische profilering. Een andere beperking is de lage resolutie van taxonomische toewijzing als gevolg van kleinere sequentiëren leesbewerkingen (150 BP of 250 BP) en het gebruik van alleen voorwaartse sequentiëring lezen (R1) als gevolg van lage kwaliteit omgekeerde sequencing leest (R2). Echter, vooruitgang in de sequencing technologie hebben geholpen om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen, zoals de mogelijkheid om sequenties langere leesbewerkingen met behulp van gepaarde eind leesbewerkingen (bijvoorbeeld, Illumina MiSeq 2x300bp).
De huidige sequencing technologie kan sequentie 600 BP goede kwaliteit leest, die het mogelijk maakt samenvoeging van R1 en R2 leest. Deze samengevoegde langere R1 en R2 leesbewerkingen toestaan betere taxonomische toewijzingen, met name met open-toegang op basis van R gebaseerde Divisive Amplicon te geven algoritme-2 (DADA2) platform. DADA2 maakt gebruik van ampliconlengte voor temp sequence variant (ASV)-gebaseerde opdrachten in plaats van de operationele taxonomische eenheid (Otu) toewijzingen op basis van 97% gelijkenis gebruikt door qiime23. ASV Matches resulteren in een exacte sequentie match in de database binnen 1 – 2 nucleotiden, wat leidt tot toewijzing op genus-en soorten niveau. Dus, de combinatie van langere, goede kwaliteit gepaarde Lees-en betere taxonomische toewijzings tools (zoals DADA2) hebben microbiome studies getransformeerd.
Hier is een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van bacteriële profilering met behulp van twee-stap versterking van de v3-v4 regio van 16S rRNA en data-analyse met behulp van DADA2, Phyloseq, en METAGENassist pijplijnen. Voor deze studie worden humane leukocytenantigeen (HLA) klasse II-transgene muizen gebruikt, aangezien bepaalde HLA klasse II-allelen zijn gekoppeld aan een aanleg voor auto-immuunziekten zoals MS20,24,25. Echter, het belang van HLA klasse II genen bij het reguleren van de samenstelling van gut microbiota is onbekend. Het is veronderstelde dat de HLA klasse II molecuul zal beïnvloeden gut microbiële Gemeenschap door te selecteren voor specifieke bacteriën. Grote histocompatibility complex (MHC) klasse II knock-outmuizen (AE Ko) of muizen die humane HLA-DQ8 moleculen (HLA-DQ8)24,25,26 uitdrukken, werden gebruikt om het belang van HLA klasse II moleculen te begrijpen in het vorm geven van de darm microbiële Gemeenschap. Er wordt aangenomen dat deze volledige en vereenvoudigde workflow met R-gebaseerde data-analyse zal dienen als een uitstekend hulpmiddel voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van microbiome profilering studies.
De generatie van muizen ontbreekt endogene Murine MHC klasse II genen (AE KO) en AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgene muizen met een C57BL/6J achtergrond is eerder beschreven26. Fecale monsters worden verzameld van muizen van beide geslachten (8 – 12 weken oud). Muizen werden eerder gefokt en onderhouden in de Universiteit van Iowa Animal Facility volgens de NIH en institutionele richtlijnen. Strategieën voor verontreinigingsbeheersing zoals het spenen van de muizen in een laminaire stromings kast, het verwisselen van handschoenen tussen verschillende stammen van muizen en het correct onderhoud van muizen zijn cruciale stappen voor profilering van het microbioom van de darmen.
Goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) worden ten zeerste aanbevolen tijdens de gehele procedure. Geschikte negatieve controles moeten worden opgenomen bij het uitvoeren van DNA-isolatie, PCR1 en PCR2 versterking en sequentiëren stappen. Het gebruik van steriele, DNase-vrije, RNase-vrije en pyrogene-vrije voorraden wordt aanbevolen. Aangewezen pipet voor microbioom werk en gefilterde pipetpunten moeten in het hele protocol worden gebruikt. Microbiota-analyse bestaat uit zeven stappen: 1) fecale monsterverzameling en-verwerking; 2) extractie van DNA; 3) 16S rRNA genamplificatie; 4) DNA-bibliotheek constructie met behulp van geïndexeerde PCR; 5) opschonen en kwantificering van de geïndexeerde PCR (Library); 6) MiSeq-sequencing; en 7) gegevensverwerking en sequentieanalyse. Een schematisch diagram van alle protocol stappen wordt weergegeven in Figuur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

De menselijke darm wordt gekoloniseerd door triljoenen bacteriën die fysiologische functies ondersteunen zoals voedsel metabolisme, energie oogsten, en regulering van het immuunsysteem. Perturbatie van de gezonde gut microbiome is gesuggereerd om een rol te spelen bij de ontwikkeling van ontstekingsziekten, met inbegrip van multiple sclerose (MS). Milieu-en genetische factoren kunnen de samenstelling van het microbiome beïnvloeden; Daarom is de identificatie van microbiële gemeenschappen in verband met een fenotype ziekte de eerste stap geworden naar het definiëren van de rol van het microbiome in gezondheid en ziekte. Gebruik van 16S rRNA metagenomic sequencing voor profilering bacteriële Gemeenschap heeft geholpen bij het bevorderen van microbiome onderzoek. Ondanks het brede gebruik is er geen uniform protocol voor 16S rRNA-gebaseerde taxonomische profilerings analyse. Een andere beperking is de lage resolutie van taxonomische toewijzing als gevolg van technische moeilijkheden zoals kleinere sequentiëren, evenals het gebruik van alleen voorwaartse (R1) leesbewerkingen in de uiteindelijke analyse als gevolg van lage kwaliteit van omgekeerde (R2) leesbewerkingen. Er is behoefte aan een vereenvoudigde methode met een hoge resolutie om de bacterie diversiteit in een bepaald biospecimen te karakteriseren. Verbeteringen in sequentiëren van technologie met de mogelijkheid om langere leesbewerkingen bij hoge resolutie te sequenties hebben geholpen om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen. Huidige sequencing technologie in combinatie met een algemeen beschikbare metagenomic analyse pijpleiding, zoals R-gebaseerde Divisive Amplicon die het algoritme-2 (DADA2) heeft geholpen om microbiële profilering bij hoge resolutie te voorkomen, omdat DADA2 sequentie kan toewijzen aan het genus en soorten. Hier beschreven is een gids voor het uitvoeren van bacteriële profilering met behulp van tweestapsversterking van de v3-v4-regio van het 16S rRNA-gen, gevolgd door analyse met behulp van vrij beschikbare analysetools (d.w.z. DADA2, Phyloseq en METAGENassist). Er wordt aangenomen dat deze eenvoudige en volledige workflow zal dienen als een uitstekend hulpmiddel voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van microbiome profilering studies.

Aangezien MHC klasse II moleculen (HLA bij mensen) centrale spelers zijn in de adaptieve immuunrespons en sterke associaties vertonen met een aanleg voor MS24,25,26, was het veronderstelde dat het HLA klasse II molecuul darm microbiële samenstelling zou beïnvloeden. Daarom werden Muizen zonder het MHC klasse II gen (AE KO) of het uitdrukken van humaan HLA-DQ8 gen (HLA-DQ8) gebruikt om het belang van HLA klasse II moleculen in ...

Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Profilering van microbioom is de eerste stap in de richting van het definiëren van de rol van microbioom in gezondheid en ziekte. Hier beschrijven we een eenvoudige procedure voor het isoleren van hoogwaardig bacterieel DNA uit fecale monstervoorbereiding bibliotheek, het uitvoeren van 16SR RNA en een meta genomic sequencing en microbioom data-analyse. Dit protocol zal onderzoekers helpen nieuw op het gebied van microbioom, evenals onderzoekers die werkzaam zijn in microbioom veld bij de oprichting van de microbioom pijpleiding in hun lab. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het profileren van microbioom van andere biomonsters zoals nasale, orale of huidmonsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Kraal plukken is de belangrijkste stappen als alle downstream stappen zijn afhankelijk van hoge kwaliteit DNA. Een goede afdichting van bewaarplaat is belangrijk omdat onvolledige afdichting kan leiden tot het onderdrukken van versterkt product, wat resulteert in sequencinggegevens van lage kwaliteit. Om te beginnen steriliseren de scheidingsbakken met 70%ethanol. Plaats de muizen in gesteriliseerde scheidingswanden en laat ze normaal poepen voor maximaal een uur. Gebruik steriele tangen om de fecale pellets te verzamelen in een lege voorgelabelde 1,5 milliliter microcentrifuge buis. Sluit de buis stevig in. Steriliseren de tangen met 70%ethanol, gevolgd door een kiemdodend wegwerpdoek, na het verzamelen van fecale van elke muis. Weeg 200 milligram fecale pellets af in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis, met 0,1 milliliter glazen kralen, en plaats de kraalbuis in een kraal die homogenisator slaat en homogenize de monsters gedurende 45 seconden bij kamertemperatuur, met een snelheid van 4,5 meter per seconde. Haal DNA volgens instructies van de kitfabrikant en elute DNA in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Na het isoleren van DNA kwantificeert u het geïsoleerde DNA door 1 microliter van het DNA op een fluorometer te laden. Setup 16S ribosomale RNA genversterking PCR1 in een 96-Well PCR plaat, met behulp van een 25 microliter reactievolume. Voeg met behulp van een multi-channel pipet 40 nano gram DNA, 13,5 micro liter 2x high-fidelity polymerase enzym mix, met buffer, plus DNTPs in voorwaartse en omgekeerde primer. Verzegel de PCR-plaat goed van boven naar beneden in alle vier de randen. En centrifuge op 1000 keer G op 20

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Karakterisering van het Microbiome van de teek door Next-Generation 16S rRNA Amplicon sequentiebepaling

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...