Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent le financement du NIAID/NIH (1R01AI137075-01), de la Carver Trust Medical Research Initiative Grant et du Centre de recherche en sciences de la santé environnementale de l'Université de l'Iowa, nieHS/NIH (P30 ES005605).

Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Iowa.
1. Collection et manipulation d'échantillons fécaux
<ol><li>Stériliser les boîtes de diviseur (voir Tableau des matériaux, Figure supplémentaire 1) avec 70 % d'éthanol.</li>
	<li>Tubes de microcentrifuge pré-étiquette (un par souris) avec l'iD de l'échantillon et le groupe de traitement (le cas échéant).</li>
	<li>Placez ...

Le protocole décrit est simple, avec des étapes faciles à suivre pour effectuer le profilage de microbiome utilisant le séquençage métagénomique de rRNA 16S à partir d'un grand nombre de biospécimens d'intérêt. Le séquençage de nouvelle génération a transformé les études sur l'écologie microbienne, en particulier dans les modèles de maladies humaines et précliniques31,32. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à analyser av...

Le microbiote désigne une collection de micro-organismes (bactéries, virus, archées, bactériophages et champignons) vivant dans un environnement particulier, et le microbiome fait référence au génome collectif des microorganismes résidents. Comme les bactéries sont l'un des microbes les plus abondants chez l'homme et la souris, cette étude se concentre uniquement sur le profilage bactérien. L'intestin humain est colonisé par des milliards de bactéries et des centaines de souches bactériennes1. Le microbiote intestinal normal joue un rôle vital dans le maintien d'un état sain dans l'hôte en régulant les fonctions (c.-à-d. le maintien d'une barrière intestinale intacte, le métabolisme alimentaire, l'homéostasie énergétique, l'inhibition de la colonisation par des organismes pathogènes, et régulation des réponses immunitaires)2,3,4,5. Les perturbations de composition du microbiote intestinal (dysbiose intestinale) ont été liées à un certain nombre de maladies humaines, y compris les troubles gastro-intestinaux6, l'obésité7,8, accident vasculaire cérébral9, cancer10, diabète8,11, polyarthrite rhumatoïde12, allergies13, et les maladies liées au système nerveux central tels que la sclérose en plaques (SEP)14,15 et la maladie d'Alzheimer maladie (AD)8,16. Par conséquent, ces dernières années, il ya eu un intérêt croissant pour les outils pour identifier la composition bactérienne à différents sites du corps. Une méthode fiable devrait avoir des caractéristiques telles que le haut débit et facile à utiliser, ayant la capacité de classer le microbiote bactérien avec une haute résolution, et d'être à faible coût.
Les techniques microbiologiques basées sur la culture ne sont pas assez sensibles pour identifier et caractériser le microbiome intestinal complexe en raison de l'échec de plusieurs bactéries intestinales à se développer en culture. L'avènement de la technologie basée sur le séquençage, en particulier le séquençage métagénomique à base de rRNA 16S, a surmonté certains de ces défis et transformé la recherche sur le microbiome17. La technologie avancée de séquençage à base de rRNA 16S a aidé à établir un rôle critique pour le microbiome intestinal dans la santé humaine. Le Projet Microbiome Humain, une initiative des Instituts Nationaux de la Santé18et le projet MetaHIT (une initiative européenne)19 ont tous deux contribué à l'établissement d'un cadre de base pour l'analyse du microbiome. Ces initiatives ont aidé à lancer de multiples études pour déterminer le rôle du microbiome intestinal dans la santé humaine et les maladies.
Un certain nombre de groupes ont montré la dysbiose intestinale dans les patients présentant des maladies inflammatoires12,14,15,20,21,22. En dépit d'être employé couramment pour le profilage taxonomique dû à la capacité au multiplexe et aux coûts bas, il n'y a aucun protocole uniforme pour le profilage taxonomique 16S rRNA-basé. Une autre limitation est la faible résolution de l'affectation taxonomique en raison de lectures de séquençage plus petites (150 bp ou 250 pb) et l'utilisation de la lecture de séquençage vers l'avant seulement (R1) en raison de la faible qualité des lectures de séquençage inverse (R2). Cependant, les progrès de la technologie de séquençage ont aidé à surmonter certains de ces défis, tels que la capacité de séquencer des lectures plus longues à l'aide de lectures à extrémité appariée (p. ex., Illumina MiSeq 2x300bp).
La technologie de séquençage actuelle peut séquencer 600 bp de bonnes lectures de bonne qualité, ce qui permet la fusion de R1 et R2 lit. Ces lectures R1 et R2 fusionnées plus longues permettent de meilleures affectations taxonomiques, en particulier avec la plate-forme d'amplicon de désamorçant de l'algorithme de désamorçant de Division-2 (DADA2) basée sur r-accès en libre accès. DADA2 utilise des affectations basées sur la variante de séquence d'amplicon (ASV) au lieu d'affectations d'unité taxonomique opérationnelle (OTU) basées sur une similitude de 97 % utilisée par QIIME23. Les correspondances ASV donnent lieu à une séquence exacte dans la base de données dans 1/2 nucléotides, ce qui conduit à l'affectation au niveau du genre et des espèces. Ainsi, la combinaison de lectures plus longues et de bonne qualité et de meilleurs outils d'affectation taxonomique (comme DADA2) a transformé les études sur le microbiome.
Fourni ici est un guide étape par étape pour effectuer le profilage bactérien en utilisant l'amplification en deux étapes de la région V3-V4 de 16S rRNA et l'analyse des données à l'aide de pipelines DADA2, Phyloseq et METAGENassist. Pour cette étude, des souris transgéniques de classe II d'antigène de leucocyte humain (HLA) sont employées, car certains allèles de classe II de HLA sont liés à une prédisposition aux maladies autoimmunes telles que MS20,24,25. Cependant, l'importance des gènes de classe II de HLA dans la régulation de la composition du microbiote intestinal est inconnue. On suppose que la molécule de classe II de HLA influencera la communauté microbienne intestinale en sélectionnant pour des bactéries spécifiques. Major histocompatibility complex (MHC) class II knockout mice (AE.KO) or mice expressing human HLA-DQ8 molecules (HLA-DQ8)24,25,26ont été utilisés afin de comprendre l'importance des molécules de classe II HLA dans façonner la communauté microbienne intestinale. On croit que ce flux de travail complet et simplifié avec l'analyse des données R servira d'excellent outil pour les chercheurs intéressés à effectuer des études de profilage des microbiomes.
La génération de souris dépourvues de gènes murine sinain sinain isancées de classe II (AE.KO) et AE-/-. HLA-DQA1-0103, DQB1-0302 (HLA-DQ8) souris transgéniques avec un fond C57BL/6J a été décrit précédemment26. Des échantillons fécaux sont prélevés sur des souris des deux sexes (8 à 12 semaines d'âge). Les souris ont déjà été élevées et entretenues dans les installations animales de l'Université de l'Iowa conformément aux lignes directrices des NIH et des institutions. Les stratégies de contrôle de la contamination telles que le soudage des souris à l'intérieur d'une armoire à débit laminaire, le changement de gants entre différentes souches de souris, et l'entretien approprié des souris sont des étapes critiques pour le profilage du microbiome intestinal.
Un équipement de protection individuelle (EPI) approprié est fortement recommandé pendant toute la procédure. Des contrôles négatifs appropriés devraient être inclus lors de l'exécution de l'isolement de l'ADN, de l'amplification PCR1 et PCR2, et des étapes de séquençage. Il est recommandé d'utiliser des fournitures stériles, sans DNase, sans NNase et sans pyrogène. Le pipettor désigné pour le travail de microbiome et les bouts filtrés de pipette devraient être employés tout au long du protocole. L'analyse du microbiote se compose de sept étapes : 1) la collecte et le traitement d'échantillons fécaux; 2) extraction d'ADN; 3) amplification de gène de rRNA de 16S ; 4) Construction de bibliothèque d'ADN utilisant le PCR indexé ; 5) nettoyage et quantification des PCR indexés (bibliothèque); 6) Séquençage MiSeq; et 7) le traitement des données et l'analyse des séquences. Un diagramme schématique de toutes les étapes du protocole est affiché dans la figure 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

L'intestin humain est colonisé par des milliards de bactéries qui soutiennent les fonctions physiologiques telles que le métabolisme alimentaire, la récolte d'énergie et la régulation du système immunitaire. La perturbation du microbiome intestinal sain a été suggérée pour jouer un rôle dans le développement des maladies inflammatoires, y compris la sclérose en plaques (SEP). Les facteurs environnementaux et génétiques peuvent influencer la composition du microbiome; par conséquent, l'identification des communautés microbiennes liées à un phénotype de la maladie est devenue la première étape vers la définition du rôle du microbiome dans la santé et la maladie. L'utilisation du séquençage métagénomique 16S rRNA pour le profilage de la communauté bactérienne a contribué à faire progresser la recherche sur le microbiome. Malgré son utilisation large, il n'y a pas de protocole uniforme pour l'analyse de profilage taxonomique basée sur l'ARNr16. Une autre limitation est la faible résolution de l'affectation taxonomique en raison de difficultés techniques telles que des lectures de séquençage plus petits, ainsi que l'utilisation de l'avant seulement (R1) lit dans l'analyse finale en raison de la faible qualité de l'inverse (R2) lit. Il est nécessaire d'avoir une méthode simplifiée à haute résolution pour caractériser la diversité bactérienne dans un biospécimen donné. Les progrès de la technologie de séquençage avec la capacité de séquencer des lectures plus longues à haute résolution ont aidé à surmonter certains de ces défis. La technologie actuelle de séquençage combinée à un pipeline d'analyse métagénomique accessible au public, comme l'amplicon de Division Denoising Algorithm-2 (DADA2) basé sur la R, a contribué à faire progresser le profilage microbien à haute résolution, car DADA2 peut assigner une séquence au genre et les niveaux d'espèces. Décrit ici est un guide pour effectuer le profilage bactérien utilisant l'amplification en deux étapes de la région V3-V4 du gène 16S rRNA, suivie d'une analyse utilisant des outils d'analyse librement disponibles (c.-à-d. DADA2, Phyloseq, et METAGENassist). On croit que ce flux de travail simple et complet sera un excellent outil pour les chercheurs intéressés à effectuer des études de profilage du microbiome.

Comme les molécules de classe II du MHC (HLA chez l'homme) sont des acteurs centraux de la réponse immunitaire adaptative et montrent de fortes associations avec une prédisposition à la SP24,25,26, on a émis l'hypothèse que la molécule de classe II HLA influencerait la composition microbienne intestinale. Par conséquent, des souris dépourvues du gène de classe II de MHC (AE.KO) ou exprimant le gène humain HLA-DQ8 (HLA...

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Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

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Le profilage du microbiome est la première étape vers la définition du rôle du microbiome dans la santé et la maladie. Ici, nous décrivons une procédure simple pour isoler l’ADN bactérien de haute qualité de l’échantillon fécal préparant la bibliothèque, effectuant l’ARN 16SR et une analyse métagénomique de données de séquençage et de microbiome. Ce protocole aidera les chercheurs nouveaux dans le domaine du microbiome, ainsi que les chercheurs travaillant dans le domaine du microbiome à établir le pipeline de microbiome dans leur laboratoire. Ce protocole peut être étendu pour le profilage du microbiome à partir d’autres spécimens biologiques tels que des échantillons nasaux, oraux ou cutanés de sujets animaux et humains. La cueillette des perles est l’étape la plus importante car toutes les étapes en aval dépendent de l’ADN de haute qualité. L’étanchéité adéquate de la plaque de conserve est importante, car l’étanchéité incomplète pourrait mener à l’oppression de produits amplifiés, ce qui entraînerait des données de séquençage de mauvaise qualité. Pour commencer, stériliser les boîtes de séparateur avec 70% d’éthanol. Placez les souris dans des boîtes de séparateur stérilisées et laissez-les déféquer normalement jusqu’à une heure. Utilisez des forceps stériles pour recueillir les granulés fécaux dans un tube de centrifugeuse micro-centrifugeuse vide préétiqueté de 1,5 millilitre. Enfermez le tube en toute sécurité. Stériliser les forceps avec 70% d’éthanol, suivi d’un lingette germicide jetable, après avoir recueilli des matières fécales de chaque souris. Pesez 200 milligrammes de granulés fécaux dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre, avec des perles de verre de 0,1 millilitre, et placez le tube de perles dans une perle battant homogénéisant et homogénéisez les échantillons pendant 45 secondes à température ambiante, à une vitesse de 4,5 mètres par seconde. Extraire l’ADN selon les instructions du fabricant du kit et électrer l’ADN dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre. Après avoir isolé l’ADN, quantifier l’ADN isolé en chargeant 1 microlitre de l’ADN sur un fluoromètre. Configuration 16S amplification du gène ARN ribosomal PCR1 dans une plaque PCR 96-Well, en utilisant un volume de réaction de 25 microlitres. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 40 nano grammes d’ADN, 13,5 micro litres de mélange d’enzymes polymésexes haute fidélité 2X, contenant du tampon, ainsi que des DNTP dans l’amorce avant et arrière. Scellez correctement la plaque PCR du haut vers le bas le long des quatre bords. Et centrifugeuse à 1000 fois G à 20

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