Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

המחברים להכיר מימון מתוך NIAID/NIH (1R01AI137075-01), המבתר אמון ביוזמת המחקר הרפואי מענק, ואת אוניברסיטת איווה הסביבה מרכז לחקר הבריאות המרכז, ארני/NIH (P30 ES005605).

הפרוטוקול אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש של אוניברסיטת איווה.
1. איסוף וטיפול בצואה לדוגמה
<ol><li>חטא את תיבות המפריד (ראה טבלת חומרים, איור משלים 1) עם 70% אתנול.</li>
	<li>לפני התווית צינורות מיקרוצנטריפוגה (אחד לכל עכבר) עם מזהה לדוגמה וקבוצת ה?...

הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, עם שלבים קל לבצע כדי לבצע פרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית 16S מספר גדול של ביומינים רבים של עניין. רצף הדור הבא השתנה לימודי אקולוגיה, במיוחד אצל מודלים אנושיים וטרום-קליניים של המחלה31,32. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לנתח ...

Microbiota מתייחס לאוסף של מיקרואורגניזמים (חיידקים, וירוסים, הארכאים, בקטריה, ופטריות) חיים בסביבה מסוימת, ו microbiota מתייחס הגנום הקולקטיבי של מיקרואורגניזמים תושב. כמו חיידקים הם אחד החיידקים הנפוצים ביותר בבני אדם ועכברים, מחקר זה מתמקד רק על פרופיל חיידקי. הבטן האנושית היא הקולוניה של טריליוני חיידקים ומאות זנים חיידקיים1. הבטן הרגילה microbiota משחק תפקיד חיוני בשמירה על מצב בריא במחשב המארח על ידי ויסות פונקציות (כלומר, תחזוקה של מחסום מעיים שלם, מטבוליזם מזון, הומאוסטזיס אנרגיה, עיכוב של הקולוניזציה על ידי אורגניזמים פתוגניים, ו תקנה של תגובות החיסון)2,3,4,5. Compositional של הבטן microbiota (בטן דיסביוזיס) קושרו למספר מחלות אנושיות, כולל הפרעות במערכת העיכול6, השמנת יתר7,8, קו9, סרטן10, סוכרת8,11, דלקת מפרקים שגרונית12, אלרגיות13, מחלות מרכז העצבים הקשורות כגון טרשת נפוצה (MS)14,15 ו אלצהיימר מחלה (AD)8,16. לכן, בשנים האחרונות, יש כבר עניין גדל בכלים לזיהוי הרכב חיידקי באתרי גוף שונים. שיטה אמינה צריכה להיות מאפיינים כגון להיות תפוקה גבוהה וקלה לשימוש, בעל היכולת לסווג microbiota חיידקי ברזולוציה גבוהה, ולהיות בעלות נמוכה.
טכניקות מיקרוביולוגית המבוססות על תרבות אינן רגישות מספיק כדי לזהות ולאפיין את מיקרובידום הבטן המורכבת בשל כישלון של מספר חיידקי הבטן לצמוח בתרבות. הופעתו של הטכנולוגיה המבוססת על רצף, במיוחד rRNA-מבוסס על רצף metagenomic, יש להתגבר על כמה אתגרים אלה והפך מחקר microbiome17. מתקדם 16S rRNA מבוסס רצף הטכנולוגיה סייעה בהקמת תפקיד קריטי עבור המעיים מיקרובידום בבריאות האדם. פרויקט המיקרובידום האנושי, המכון הלאומי ליזמות בריאותית18, ופרויקט המטהיט (יוזמה אירופאית)19 שניהם סייעו בהקמת מסגרת בסיסית לניתוח מיקרובידום. יוזמות אלה סייעו בעיטה-להתחיל מחקרים מרובים כדי לקבוע את התפקיד של מיקרובידום בטן האדם בריאות ומחלות.
מספר קבוצות הראו תחושת בטן בחולים עם מחלות דלקתיות12,14,15,20,21,22. למרות שנעשה שימוש נרחב בפרופיל מסים בשל היכולת ליצור מולטיפלקס ועלויות נמוכות, אין פרוטוקולים אחידים עבור פרופיל מטקמי מבוסס 16S. מגבלה נוספת היא ברזולוציה נמוכה של משימה מטקמיים בשל קריאות ברצף קטן יותר (150 bp או 250 bp) ושימוש ברצף הקדמי רק לקרוא (R1) עקב באיכות נמוכה ברצף הפוכה קריאות (R2). עם זאת, ההתקדמות בטכנולוגיית הרצף סייעה להתגבר על חלק מהאתגרים הללו, כגון היכולת לרצף יותר באמצעות קריאות מזווג-end (למשל, מאייר מיseq 2x300bp).
הטכנולוגיה הנוכחית ברצף יכול לרצף 600 bp באיכות טובה קורא, אשר מאפשר מיזוג של R1 ו R2 קורא. אלה ממוזגים עוד R1 ו-R2 קורא לאפשר משימות מיסוי טוב יותר, במיוחד עם גישה פתוחה R-מבוסס מגדלהעל מתחת מערכת האלגוריתם Denoising הפלטפורמה 2 (DADA2) פלטפורמת. DADA2 מנצל אמפליקון רצף variant (asv) משימות מבוססות במקום יחידת מיסים מבצעית (otu) הקצאות מבוסס על 97% דמיון מנוצל על ידי qiime23. ASV גפרורים התוצאה במשחק רצף מדויק במסד הנתונים בתוך 1-2 נוקלאוטידים, אשר מוביל הקצאה בסוג ורמות מינים. כך, שילוב של זמן רב יותר, באיכות טובה לזווג וכלים הקצאה טובה יותר (כגון DADA2) הפכו לימודי מיקרובידום.
בתנאי זה מדריך צעד אחר צעד לביצוע פרופיל חיידקי באמצעות הגברה של שני השלבים של האזור V3-V4 של 16S rRNA וניתוח נתונים באמצעות DADA2, Phyloseq, ו-Metאגנאסיל לסייע צינורות. עבור מחקר זה, אנטיגן לוקיציט אנושי (hla) בכיתה ii עכברים הטרנסגניים משמשים, כמו hla class ii אללים מקושרים עם נטייה מחלות אוטואימוניות כגון MS20,24,25. עם זאת, החשיבות של הגנים השנייה בכיתה HLA בוויסות הרכב של מיקרוביוטה בטן אינו ידוע. היפותזה היא כי מולקולת HLA class II ישפיע על הקהילה מיקרוביאלית של הבטן על ידי בחירת חיידקים ספציפיים. מורכב היסטוליאני מורכבים (mhc) מחלקה II עכברים (AE. KO) או עכברים המבטא האדם hla-DQ8 מולקולות (hla-DQ8)24,25,26 שימשו כדי להבין את החשיבות של hla class II מולקולות ב עצב את הקהילה הבין-מיקרוביאלית. הוא האמין כי זרימת עבודה זו מלאה ומפושטת עם ניתוח נתונים מבוססי R ישמש ככלי מצוין עבור החוקרים המעוניינים בביצוע מחקרים בפרופיל microbiome.
הדור של עכברים חסר אנדודוגני מורה MHC מחלקה II גנים (AE. KO) ו-AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) העכברים הטרנסגניים עם רקע C57BL/6J כבר תיאר בעבר26. דגימות צואה נאספו מעכברים של שני המינים (8-12 שבועות של גיל). עכברים התרבו בעבר ונשמרו ב אוניברסיטת איווה מתקן בעלי חיים לפי הנחיות NIH ומוסדיים. זיהום אסטרטגיות שליטה כגון הגמילה של עכברים בתוך הקבינט הזרם למינארי, שינוי של כפפות בין זנים שונים של עכברים, ותחזוקה נאותה של עכברים הם צעדים קריטיים עבור פרופיל של מיקרובידום בטן.
ציוד הגנה אישי מתאים (PPE) מומלץ מאוד במהלך ההליך כולו. יש לכלול פקדים שליליים מתאימים בעת ביצוע בידוד DNA, PCR1 ו-PCR2 הגברה ושלבי הרצף. מומלץ להשתמש בציוד סטרילי, ללא תשלום, RNase-free ו-pyrogen-חינם. מומלץ להשתמש בצנרת המיועדת לעבודה במיקרו-מיקרו ובטיפים מסוננים לאורך כל הפרוטוקול. ניתוח microbiota מורכב משבעה שלבים: 1) לדוגמה בצואה איסוף ועיבוד; 2) הוצאת דנ א; 3) 16S rRNA הגברה הגנים; 4) בניית ספריית דנ א באמצעות PCR באינדקס; 5) ניקוי וכימות של ה-PCR הכלול באינדקס (ספריה); 6) רצף מיseq; ו -7) ניתוח נתונים ועיבוד רצף. דיאגרמה סכמטית של כל שלבי הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

הבטן האנושית היא הקולוניה של טריליוני חיידקים התומכים בפונקציות פיזיולוגיות כגון מטבוליזם המזון, קצירת האנרגיה והוויסות של המערכת החיסונית. הסתעפות של מיקרובידום המעיים הבריא הוצע לשחק תפקיד בפיתוח מחלות דלקתיות, כולל טרשת נפוצה (MS). גורמים סביבתיים וגנטיים יכולים להשפיע על ההרכב של המיקרובידום; לכן, זיהוי של קהילות מיקרוביאלית המקושרים עם פנוטיפ המחלה הפך לצעד הראשון להגדרת התפקיד של microbiome בריאות ומחלות. השימוש ברצפי המידע של הקהילה החיידקית של 16S, עזר בקידום מחקר מיקרובידום. למרות השימוש הנרחב שלה, אין פרוטוקול אחיד עבור ניתוח מבוססי מיסים של 16 s rRNA בפרופיל. מגבלה נוספת היא ברזולוציה נמוכה של הקצאת מיסים עקב קשיים טכניים כגון קריאות ברצף קטן יותר, כמו גם השימוש בלבד (R1) קורא בניתוח הסופי עקב איכות נמוכה של הפוכה (R2) קורא. יש צורך בשיטה פשוטה עם רזולוציה גבוהה לאפיון מגוון חיידקי בביודגימה נתונה. התקדמויות בטכנולוגיית רצף עם היכולת רצף קריאות ארוכות יותר ברזולוציה גבוהה סייעו להתגבר על חלק מהאתגרים אלה. הנוכחי ברצף הטכנולוגיה בשילוב עם צינור ניתוח מטאגנמית זמין לציבור כמו R מבוססי מגדרהמערכות האלגוריתם Denoאיזינג-2 (DADA2) עזר לקדם פרופיל מיקרוביאלית ברזולוציה גבוהה, כמו DADA2 יכול להקצות רצף בסוג ורמות המינים. המתואר כאן הוא מדריך לביצוע פרופילים חיידקיים באמצעות שני הגברה של האזור V3-V4 של הגנים של 16 s rRNA, ואחריו ניתוח באמצעות כלי ניתוח זמין בחופשיות (כלומר, DADA2, Phyloseq, ו-Metאגנאסיל). הוא האמין כי זרימת עבודה פשוטה ומלאה תשמש ככלי מצוין עבור החוקרים המעוניינים בביצוע מחקרים בפרופיל microbiome.

כמו mhc class ii מולקולות (hla בבני אדם) הם שחקנים מרכזיים בתגובה החיסונית אדפטיבית להראות אסוציאציות חזקות עם נטייה MS24,25,26, זה היה היפותזה כי hla class ii מולקולה ישפיע. על הרכב מחיידקים לכן, עכברים חסרים את הגן השני MHC מחלקה II (AE. KO) או ביטוי האדם HLA-DQ8 גן...

Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

פרופיל של מיקרוביום הוא הצעד הראשון לקראת הגדרת התפקיד של מיקרוביום בבריאות ומחלות. כאן, אנו מתארים הליך פשוט לבודד DNA חיידקי באיכות גבוהה מדגימה צואה הכנת הספרייה, ביצוע 16SR RNA רצף מטא גנומי וניתוח נתונים מיקרוביום. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים חדשים בתחום המיקרוביום, כמו גם לחוקרים העובדים בתחום המיקרוביום בהקמת צינור המיקרוביום במעבדה שלהם. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עבור פרופיל של מיקרוביום מדגימות ביולוגיות אחרות כגון דגימות האף, הפה או העור של בעלי חיים ונבדקים אנושיים. קטיף חרוזים הוא הצעדים החשובים ביותר גם כאשר כל השלבים במורד הזרם תלויים בדנ"א באיכות גבוהה. איטום נכון של צלחת שימור חשוב כמו איטום שלם עלול להוביל לדיכוי של מוצר מוגבר וכתוצאה מכך נתוני רצף באיכות נמוכה. כדי להתחיל, לעקר את תיבות המפריד עם 70% אתנול. מניחים את העכברים בקופסאות מחיצה מעקרות ומאפשרים להם לעשות את צרכיהם כרגיל עד שעה. השתמש מדפים סטריליים כדי לאסוף את כדורי צואה בצינור ריק מראש שכותרתו 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה. תסגור את הצינור בצורה מאובטחת. לעקר את המדפים עם 70%אתנול, ואחריו מגבון חד פעמי germicidal, לאחר איסוף צואה מכל עכבר. שוקלים 200 מיליגרם של כדורי צואה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר, עם 0.1 מיליליטר בחנורי זכוכית, ומ מניחים את צינור חרוז לתוך חרוז להכות homogenizer ולהומוגניזציה הדגימות במשך 45 שניות בטמפרטורת החדר, במהירות של 4.5 מטרים לשנייה. לחלץ DNA לפי הוראות של יצרן הערכה ולחמק DNA בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר בידוד ה-DNA, לכמת את ה-DNA מבודד על ידי טעינת 1 microliter של ה-DNA על פלואורומטר. התקנה 16S ריבוזומלי RNA גנים הגברה PCR1 בצלחת PCR 96-Well, באמצעות נפח תגובה 25 מיקרוליטר. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 40 ננו גרם של DNA, 13.5 מיקרו ליטר של 2X תערובת אנזים פולימראז בנאמנות גבוהה, המכיל חיץ, בתוספת DNTPs קדימה ואחורי פריימר. לאטום את לוח PCR כראוי מלמעלה למטה לאורך כל ארבעת הקצוות. וצנטריפוגה ב 1000 פעמים G ב 20

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...