Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Gli autori riconoscono il finanziamento del NIAID/NIH (1R01AI137075-01), del Carver Trust Medical Research Initiative Grant e del Centro di ricerca sulle scienze ambientali dell'Università dell'Iowa, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa.
1. Raccolta e movimentazione dei campioni fecali
<ol><li>Sterilizzare le caselle divisorie (vedere Tabella dei materiali, Figura supplementare 1) con 70% di etanolo.</li>
	<li>Tubi di microcentrifuga pre-etichetta (uno per mouse) con l'ID del campione e il gruppo di trattamento (se applicabile).</li>
	<li>Mettere i topi in scatole divisor...

Il protocollo descritto è semplice, con misure facili da seguire per eseguire la profilazione del microbioma utilizzando il sequenziamento metagenomico di rRNA 16S da un gran numero di biocampioni di interesse. Il sequenziamento di nuova generazione ha trasformato gli studi sull'ecologia microbica, in particolare nei modelli di malattia umana e pre-clinica31,32. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di analizzare con successo complesse co...

Microbiota si riferisce a una raccolta di microrganismi (batteri, virus, archea, batteriofagi e funghi) che vivono in un particolare ambiente, e il microbioma si riferisce al genoma collettivo dei microrganismi residenti. Poiché i batteri sono uno dei microbi più abbondanti negli esseri umani e nei topi, questo studio si concentra solo sulla profilazione batterica. L'intestino umano è colonizzato da trilioni di batteri e centinaia di ceppi batterici1. Il microbiota intestinale normale svolge un ruolo vitale nel mantenere uno stato sano nell'ospite regolando le funzioni (cioè il mantenimento di una barriera intestinale intatta, il metabolismo alimentare, l'omeostasi energetica, l'inibizione della colonizzazione da parte di organismi patogeni, e regolazione delle risposte immunitarie)2,3,4,5. Le perturbazioni compositive del microbiota intestinale (disbiosi intestinale) sono state collegate a una serie di malattie umane, tra cui disturbi gastrointestinali6, obesità7,8, ictus9, cancro10, diabete8,11, artrite reumatoide12, allergie13, e malattie del sistema nervoso centrale come la sclerosi multipla (MS)14,15 e Morbo di Alzheimer malattia (AD)8,16. Pertanto, negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse per gli strumenti per identificare la composizione batterica in diversi siti del corpo. Un metodo affidabile dovrebbe avere caratteristiche come essere ad alto consumo e facile da usare, avere la capacità di classificare microbiota batterico ad alta risoluzione ed essere a basso costo.
Le tecniche microbiologiche basate sulla cultura non sono abbastanza sensibili da identificare e caratterizzare il complesso microbioma intestinale a causa del fallimento di diversi batteri intestinali a crescere in coltura. L'avvento della tecnologia basata sul sequenziamento, in particolare il sequenziamento metagenomico basato su rRNA 16S, ha superato alcune di queste sfide e ha trasformato la ricerca sul microbioma17. La tecnologia avanzata di sequenziamento basata sull'rRNA 16S ha contribuito a stabilire un ruolo fondamentale per il microbioma intestinale nella salute umana. Il Progetto microbioma umano, l'iniziativa18dei National Institutes of Health e il progetto MetaHIT (un'iniziativa europea)19 hanno entrambi contribuito a stabilire un quadro di base per l'analisi del microbioma. Queste iniziative hanno contribuito a dare il via a più studi per determinare il ruolo del microbioma intestinale nella salute umana e nella malattia.
Un certo numero di gruppi hanno mostrato disbiosi intestinale in pazienti con malattie infiammatorie12,14,15,20,21,22. Nonostante sia ampiamente usato per la profilazione tassonomica a causa della capacità di multiplex e dei bassi costi, non esistono protocolli uniformi per la profilazione tassonomica basata su rRNA 16S. Un'altra limitazione è la bassa risoluzione dell'assegnazione tassonomica a causa di letture di sequenziamento più piccole (150 bp o 250 bp) e l'uso di sola lettura di sequenziamento in avanti (R1) a causa di letture di sequenziamento inverso di bassa qualità (R2). Tuttavia, i progressi nella tecnologia di sequenziamento hanno contribuito a superare alcune di queste sfide, come la possibilità di sequenziare letture più lunghe utilizzando letture a coppie (ad esempio, Illumina MiSeq 2x300bp).
L'attuale tecnologia di sequenziamento è in grado di sequenziare letture di buona qualità da 600 bp, che consentono la fusione di letture R1 e R2. Queste letture R1 e R2 più lunghe consentono migliori assegnazioni tassonomiche, in particolare con la piattaforma Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basata su R ad accesso aperto. DADA2 utilizza assegnazioni basate su variante di sequenza di ampiezza (ASV) anziché assegnazioni operative di unità tassonomiche (OTU) basate sulla somiglianza del 97% utilizzata da QIIME23. Le partite ASV generano una corrispondenza esatta nella sequenza nel database all'interno di 1–2 nucleotidi, il che porta all'assegnazione a livello di genere e specie. Così, la combinazione di letture accoppiate accoppiate più lunghe e di buona qualità e migliori strumenti di assegnazione tassonomica (come DADA2) hanno trasformato gli studi sul microbioma.
Di seguito è fornita una guida passo-passo per eseguire la profilazione batterica utilizzando l'amplificazione in due fasi della regione V3-V4 di rRNA 16S e l'analisi dei dati utilizzando pipeline DADA2, Phyloseq e METAGENassist. Per questo studio, vengono utilizzati topi transgenici di classe II dell'antigene leucocito umano (HLA), poiché alcuni alleli di classe HLA II sono collegati con una predisposizione a malattie autoimmuni come MS20,24,25. Tuttavia, l'importanza dei geni di classe II HLA nella regolazione della composizione del microbiota intestinale è sconosciuta. Si ipotizza che la molecola di classe HLA II influenzerà la comunità microbica intestinale selezionando per batteri specifici. I principali topi da knockout di classe II (MHC) di classe II (AE.KO) o topi che esprimono molecole umane HLA-DQ8 (HLA-DQ8)24,25,26 sono stati utilizzati per comprendere l'importanza delle molecole HLA di classe II plasmare la comunità microbica intestinale. Si ritiene che questo flusso di lavoro completo e semplificato con l'analisi dei dati basata su R servirà come un eccellente strumento per i ricercatori interessati a eseguire studi di profilazione del microbioma.
La generazione di topi privi di geni murini MHC di classe II (AE.KO) e AE-/-. I topi transgenici HLA-DQA1-0103, DQB1-0302 (HLA-DQ8) con sfondo C57BL/6J sono stati descritti in precedenza26. I campioni fecali sono raccolti da topi di entrambi i sessi (8-12 settimane di età). I topi sono stati precedentemente allevati e mantenuti nella struttura animale dell'Università dell'Iowa in base alle linee guida NIH e istituzionali. Le strategie di controllo della contaminazione come lo svebilamento dei topi all'interno di un armadio di flusso laminare, il cambio dei guanti tra diversi ceppi di topi e la corretta manutenzione dei topi sono i passaggi fondamentali per la profilazione del microbioma intestinale.
Durante l'intera procedura sono altamente raccomandati dispositivi di protezione personale (PPE) adeguati. Quando si eseguono l'isolamento del DNA, l'amplificazione PCR1 e PCR2 e i passaggi di sequenziamento, è necessario includere controlli negativi appropriati. Si raccomanda l'uso di forniture sterili, prive di DNase, senza RNase e pirogeni. Per tutto il protocollo è necessario utilizzare il pipettor designato per il lavoro con microbioma e le punte filtrate delle pipette. L'analisi microbiota è costituita da sette fasi: 1) raccolta e lavorazione dei campioni fecali; 2) estrazione del DNA; 3) 16S amplificazione del gene rRNA; 4) costruzione della libreria del DNA mediante PCR indicizzato; 5) pulizia e quantificazione della PCR indicizzata (libreria); 6) Sequenziamento MiSeq; e 7) elaborazione dei dati e analisi delle sequenze. Nella Figura 1viene illustrato un diagramma schematico di tutti i passaggi di protocollo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

L'intestino umano è colonizzato da trilioni di batteri che supportano le funzioni fisiologiche come il metabolismo alimentare, la raccolta di energia e la regolazione del sistema immunitario. È stato suggerito che la perturbazione del microbioma intestinale sano svolga un ruolo nello sviluppo di malattie infiammatorie, compresa la sclerosi multipla (MS). I fattori ambientali e genetici possono influenzare la composizione del microbioma; pertanto, l'identificazione delle comunità microbiche legate a un fenotipo della malattia è diventata il primo passo verso la definizione del ruolo del microbioma nella salute e nella malattia. L'uso del sequenziamento metagenomico di rRNA 16S per la profilazione della comunità batterica ha contribuito a far progredire la ricerca sul microbioma. Nonostante il suo ampio uso, non esiste un protocollo uniforme per l'analisi di profilazione tassonomica basata su rRNA 16S. Un'altra limitazione è la bassa risoluzione dell'assegnazione tassonomica a causa di difficoltà tecniche come letture di sequenziamento più piccole, così come l'uso di letture solo in avanti (R1) in ultima analisi a causa della bassa qualità delle letture inverse (R2). È necessario un metodo semplificato con alta risoluzione per caratterizzare la diversità batterica in una determinata biocampione. I progressi nella tecnologia di sequenziamento con la capacità di sequenziare letture più lunghe ad alta risoluzione hanno contribuito a superare alcune di queste sfide. L'attuale tecnologia di sequenziamento combinata con una pipeline di analisi metagenomica disponibile al pubblico, come l'Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basato su R, ha contribuito a far progredire la profilazione microbica ad alta risoluzione, poiché DADA2 può assegnare la sequenza al genere e i livelli delle specie. Di seguito è descritta una guida per l'esecuzione della profilazione batterica utilizzando l'amplificazione in due fasi della regione V3-V4 del gene rRNA 16S, seguita dall'analisi mediante analisi liberamente disponibili (ad esempio, DADA2, Phyloseq e METAGENassist). Si ritiene che questo flusso di lavoro semplice e completo servirà come un ottimo strumento per i ricercatori interessati a eseguire studi di profilazione del microbioma.

Poiché le molecole MHC di classe II (HLA negli esseri umani) sono attori centrali nella risposta immunitaria adattiva e mostrano forti associazioni con una predisposizione alla MS24,25,26, si è ipotizzato che la molecola HLA di classe II influenzerebbe la composizione microbica intestinale. Pertanto, i topi privi del gene MHC di classe II (AE.KO) o che esprimono il gene umano HLA-DQ8 (HLA-DQ8) sono stati utilizzati per compren...

Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

La profilazione del microbioma è il primo passo verso la definizione del ruolo del microbioma nella salute e nelle malattie. Qui, stiamo descrivendo una semplice procedura per isolare il DNA batterico di alta qualità dalla libreria di preparazione del campione fecale, eseguendo l'RNA 16SR e un sequenziamento meta genomico e l'analisi dei dati del microbioma. Questo protocollo aiuterà i ricercatori nuovi nel campo del microbioma, così come i ricercatori che lavorano nel campo del microbioma nella creazione della pipeline del microbioma nel loro laboratorio. Questo protocollo può essere esteso per la profilazione del microbioma da altri campioni bio come campioni nasali, orali o cutanei di soggetti animali e umani. La raccolta delle perline è il passo più importante in quanto tutti i passaggi a valle dipendono da DNA di alta qualità. Una corretta sigillatura della piastra di conservazione è importante in quanto la sigillatura incompleta potrebbe portare all'opprimente del prodotto amplificato con conseguente dati di sequenziamento di bassa qualità. Per iniziare, sterilizzare le scatole divisori con il 70% di etanolo. Posizionare i topi in scatole divisorie sterilizzate e consentire loro di defecare normalmente per un massimo di un'ora. Utilizzare forcep sterili per raccogliere i pellet fecali in un tubo di micro centrifuga vuoto pre-etichettato da 1,5 millilitri. Racchiudere il tubo in modo sicuro. Sterilizzare le forcep con il 70% di etanolo, seguite da una salvietta monouso germicida, dopo aver raccolto fecale da ogni topo. Pesare 200 milligrammi di pellet fecali in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri, con perline di vetro da 0,1 millilitro, e posizionare il tubo di perline in un omogeneizzatore che batte le perline e omogeneizzare i campioni per 45 secondi a temperatura ambiente, ad una velocità di 4,5 metri al secondo. Estrarre il DNA secondo le istruzioni del produttore del kit ed elute DNA in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver isolato il DNA, quantificare il DNA isolato caricando 1 microlitro del DNA su un fluorometro. Imposta l'amplificazione genica dell'RNA ribosomiale 16S PCR1 in una piastra PCR a 96 pozzetti, utilizzando un volume di reazione di 25 microliter. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 40 nano grammi di DNA, 13,5 micro litri di miscela enzimatica polimerasi ad alta fedeltà 2X, contenente tampone, più DNTP in primer avanti e indietro. Sigillare correttamente la piastra PCR dall'alto verso il basso lungo tutti e quattro i bordi. E centrifuga a 1000 volte G a 20

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Ricerca

Biologia

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactoma-Seq: Un protocollo per la costruzione della libreria Domainome, la convalida e la selezione di Phage Display e sequenziamento di nuova generazione

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Un protocollo di estrazione del DNA delle zanzare a base di perline magnetiche per il sequenziamento di nuova generazione

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...