Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

저자는 NIAID /NIH (1R01AI137075-01), 카버 트러스트 의학 연구 이니셔티브 보조금, 아이오와 환경 건강 과학 연구 센터, NIEHS / NIH (P30 ES005605)의 자금 지원을 인정합니다.

이 프로토콜은 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 배설물 샘플 수집 및 취급
<ol><li>70% 에탄올로 디바이더 박스(재료 표, 보충 그림 1참조)를 살균합니다.</li>
	<li>샘플 ID 및 처리 그룹(해당하는 경우)과 함께 미세원심분리튜브(마우스당 1개)를 사전 라벨을 붙인다.</li>
	<li>생쥐를 멸균된 칸막이 상자에 놓고 최대...

기재된 프로토콜은 많은 수의 생물표본으로부터 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱을 사용하여 미생물군유전체 프로파일링을 수행하기 쉬운 단계로 간단합니다. 차세대 염기서열 분석은 특히 인간 및 전임상 질환 모델31,32에서미생물 생태학 연구를 변화시켰다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량 수준과 저렴한 비용32에서주어진 생물 표본에?...

미생물은 특정 환경에 서식하는 미생물(박테리아, 바이러스, 고고학, 박테리오파지 및 곰팡이)의 집합체를 말하며, 미생물군유전체는 상주 미생물의 집단 게놈을 의미한다. 박테리아는 인간과 마우스에 있는 가장 풍부한 세균의 한개이기 때문에, 이 연구 결과는 세균성 프로파일링에만 집중됩니다. 인간의 창 자 박테리아와 세균 균의 수백의 수조에 의해식민지화 1. 정상적인 장내 미생물은 기능 조절(즉, 그대로 장 장벽 유지, 식품 대사, 에너지 항상성, 병원성 유기체에 의한 식민지화 억제) 및 면역 반응의 조절)2,3,4,5. 창자 미생물의 조성 섭동(gut dysbiosis)은 위장장애6,비만7,8,뇌졸중9,암10,위장장애 등 다수의 인간 질환과 관련이 있다. 당뇨병8,11,류마티스 관절염12,알레르기13,다발성 경화증 (MS)14,15 및 알츠하이머병과 같은 중추 신경계 관련 질환 질병 (AD)8,16. 따라서, 최근에는, 다른 바디 사이트에 세균성 조성물을 확인하기 위한 공구에 대한 관심이 증가하고 있다. 신뢰할 수 있는 방법은 처리량이 높고 사용하기 쉬운 방법, 고분해능으로 세균성 미생물을 분류하는 능력, 저비용 인 것과 같은 특성을 가져야 합니다.
배양 기반 의 미생물 학적 기술은 문화에서 성장하는 여러 장내 박테리아의 실패로 인해 복잡한 창자 미생물군유전체를 식별하고 특성화할 만큼 민감하지 않습니다. 시퀀싱 기반 기술, 특히 16S rRNA 기반 의 metagenomic 시퀀싱의 출현은 이러한 과제 중 일부를 극복하고 미생물군유전체 연구17을변화시켰다. 고급 16S rRNA 기반 시퀀싱 기술은 인간의 건강에 있는 창자 미생물군유전체에 대한 중요한 역할을 확립하는 데 도움이 되었습니다. 인간 미생물군유전체 프로젝트, 국립 보건원 이니셔티브18,메타히트 프로젝트(유럽 이니셔티브)19는 모두 미생물군유전체 분석을 위한 기본 프레임워크를 수립하는 데 도움을 주었습니다. 이러한 이니셔티브는 인간의 건강과 질병에 있는 창자 microbiome의 역할을 결정하기 위하여 다중 연구 결과를 걷어차는 것을 도왔습니다.
많은 그룹이 염증성 질환 환자에서 장 이영양증을12,14,15,20,21,22로나타났습니다. 멀티플렉스 및 저비용으로 인해 분류학적 프로파일링에 널리 사용되고 있음에도 불구하고 16S rRNA 기반 분류학적 프로파일링을 위한 균일한 프로토콜은 없습니다. 또 다른 제한은 작은 시퀀싱 읽기 (150 bp 또는 250 bp)로 인해 분류 학적 할당의 낮은 해상도와 낮은 품질의 역시퀀싱 읽기 (R2)로 인해 정방향 시퀀싱 읽기 (R1)의 사용입니다. 그러나 시퀀싱 기술의 발전은 페어링 된 끝 읽기 (예 : Illumina MiSeq 2x300bp)를 사용하여 더 이상 읽기를 순서를 정하는 기능과 같은 몇 가지 문제를 극복하는 데 도움이되었습니다.
현재의 시퀀싱 기술은 600bp의 양질의 읽기를 시퀀싱할 수 있어 R1및 R2 판독을 병합할 수 있습니다. 이러한 병합 된 더 이상 R1 및 R2 읽기는 특히 오픈 액세스 R 기반 분열 앰플리온 디노이징 알고리즘-2 (DADA2) 플랫폼과 함께, 더 나은 분류학적 할당을 할 수 있습니다. DADA2는 QIIME23에서사용하는 97%의 유사성을 기반으로 운영 분류 장치(OTU) 할당 대신 앰플리톤 서열 변형(ASV) 기반 할당을 사용합니다. ASV 일치는 속과 종 수준에 할당에 이르게 1-2 뉴클레오티드 내에서 데이터베이스에서 정확한 서열 일치를 초래한다. 따라서, 더 길고, 좋은 품질의 페어링 엔드 읽기와 더 나은 분류학적 할당 도구(예: DADA2)의 조합은 미생물군유전체 연구를 변화시켰습니다.
여기에 제공된 16S rRNA의 V3-V4 영역의 2단계 증폭및 DADA2, Phyloseq 및 METAGENassist 파이프라인을 사용한 데이터 분석을 사용하여 세균 프로파일링을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제공됩니다. 본 연구를 위해, 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 형질전환 마우스가 사용되고, 특정 HLA 클래스 II 알레르는 MS20,24,25와같은 자가면역 질환에 대한 경향과 연결된다. 그러나, 창 자 microbiota의 구성을 조절에 HLA 클래스 II 유전자의 중요성은 알 수 없습니다. HLA 클래스 II 분자는 특정 박테리아를 선택하여 창자 미생물 커뮤니티에 영향을 미칠 것이라고 가설. 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II 녹아웃 마우스(AE.KO) 또는 인간 HLA-DQ8 분자(HLA-DQ8)24,25,26을 발현하는 마우스에서 HLA 클래스 II 분자의 중요성을 이해하기 위해 사용되었다. 창자 미생물 커뮤니티를 형성. R 기반 데이터 분석을 통해 완전하고 간소화된 워크플로우가 미생물군유전체 프로파일링 연구를 수행하는 데 관심이 있는 연구자를 위한 훌륭한 도구가 될 것으로 믿습니다.
내인성 뮤린 MHC 클래스 II 유전자(AE.KO) 및AE-/-결여된 마우스의 생성. HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) C57BL/6J 배경을 가진 형질전환 마우스는 앞서26에기재되어 있다. 배설물 샘플은 남녀 모두의 마우스에서 수집됩니다 (8-12 나이의 주). 마우스는 이전에 NIH 및 기관 지침에 따라 아이오와 대학 동물 시설에서 사육 및 유지되었습니다. 층류 캐비닛 내부에 마우스의 이유비, 마우스의 다른 변종 사이 장갑의 변경 및 마우스의 적당한 유지와 같은 오염 통제 전략은 창자 microbiome의 프로파일링을 위한 중요한 단계입니다.
적절한 개인 보호 장비 (PPE)는 전체 절차 중에 적극 권장됩니다. DNA 절연, PCR1 및 PCR2 증폭 및 시퀀싱 단계를 수행할 때 적절한 음성 제어가 포함되어야 합니다. 멸균, DNase 프리, RNase 및 파이로겐이 없는 소모품을 사용하는 것이 좋습니다. 미생물군유전체 작업및 여과된 파이펫 팁을 위한 지정된 피펫터는 프로토콜 전반에 걸쳐 사용해야 합니다. Microbiota 분석은 7단계로 이루어져 있습니다: 1) 대변 샘플 수집 및 처리; 2) DNA의 추출; 3) 16S rRNA 유전자 증폭; 4) 인덱싱된 PCR을 이용한 DNA 라이브러리 구축; 5) 인덱싱된 PCR(라이브러리)의 정리 및 정량화; 6) 미세크 시퀀싱; 및 7) 데이터 처리 및 시퀀스 분석. 모든 프로토콜 단계의 회로도다이어는 그림 1에나와 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

인간의 창 자 음식 대사 등 생리 기능을 지 워 하는 박테리아의 수조에 의해 식민지화, 에너지 수확, 그리고 면역 체계의 규칙. 건강한 장내 미생물군유전체의 교란은 다발성 경화증(MS)을 포함한 염증성 질환의 발병에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 환경 및 유전 적 요인은 미생물군유전체의 조성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 질병 표현형과 연결된 미생물 군사회의 확인은 건강과 질병에 있는 미생물군유전체의 역할을 정의하는 쪽으로 첫번째 단계가 되었습니다. 세균 성 커뮤니티 프로파일링을 위한 16S rRNA 메타지놈 시퀀싱의 사용은 미생물군유전체 연구를 발전시키는 데 도움이 되었습니다. 그것의 넓은 사용에도 불구하고, 16S rRNA 기지를 둔 분류학 프로파일링 분석을 위한 균일한 프로토콜은 없습니다. 또 다른 한계는 작은 시퀀싱 읽기와 같은 기술적 어려움으로 인한 분류학적 할당의 낮은 해상도뿐만 아니라 역방향(R2) 읽기의 낮은 품질로 인해 최종 분석에서 만 전달(R1)의 사용이 읽힌다. 주어진 생물 표본에서 세균의 다양성을 특성화하기 위해 고해상도로 단순화 된 방법이 필요합니다. 고해상도에서 더 이상 읽기를 순서대로 정렬할 수 있는 시퀀싱 기술의 발전은 이러한 과제를 극복하는 데 도움이 되었습니다. 현재시퀀싱 기술은 R 기반 분열 Amplicon Denoising 알고리즘-2(DADA2)와 같은 공개적으로 이용 가능한 메타지노믹 분석 파이프라인과 결합되어 다다2가 속에서 서열을 할당할 수 있기 때문에 고해상도에서 미생물 프로파일링을 진행하는 데 도움이 되었습니다. 종 수준. 여기서 설명된 것은 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역의 2단계 증폭을 이용하여 세균 프로파일링을 수행하기 위한 가이드이며, 이어서 자유롭게 이용 가능한 분석 도구(즉, DADA2, Phyloseq 및 METAGENassist)를 사용하여 분석한다. 이 간단하고 완전한 워크플로우가 미생물군유전체 프로파일링 연구에 관심이 있는 연구자들을 위한 훌륭한 도구가 될 것으로 믿습니다.

MHC 클래스 II 분자(인간HLA)는 적응형 면역 반응의 중심적인 플레이어이며 MS24,25,26에대한 경향과의 강한 연관성을 나타내고, HLA 클래스 II 분자가 있다고 가설하였다. 장 내 미생물 구성에 영향을 미칠 것 이다. 따라서, MHC 클래스 II 유전자(AE.KO) 또는 발현하는 인간 HLA-DQ8 유전자(HLA-DQ8)가 결여된 마우스는 장내 미생물 군을 형성?...

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Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

미생물군유전체의 프로파일링은 건강과 질병에서 미생물군유전체의 역할을 정의하는 첫 번째 단계입니다. 여기에서는 16SR RNA 및 메타 게놈 시퀀싱 및 미생물군유전체 데이터 분석을 수행하면서 배설물 샘플 에서 고품질의 세균 DNA를 분리하는 간단한 절차를 설명하고 있습니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야의 새로운 연구자뿐만 아니라 미생물군유전체 분야에서 일하는 연구원들이 실험실에서 미생물군유전체 파이프라인을 확립하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜은 비강, 구강 또는 동물 및 인간 피험자의 피부 샘플과 같은 다른 생체 표본에서 미생물군유전체프로파일링을 위해 확장될 수 있습니다. 모든 다운스트림 단계는 고품질 DNA에 따라 달라지기 때문에 비드 피킹이 가장 중요한 단계입니다. 불완전한 밀봉이 증폭된 제품을 압박하여 품질 이격 데이터를 낮게 유도할 수 있으므로 보존 플레이트의 적절한 밀봉이 중요합니다. 먼저 디바이더 박스를 70%에탄올로 소독합니다. 살균 된 칸막이 상자에 마우스를 놓고 최대 1 시간 동안 정상적으로 배변 할 수 있습니다. 멸균 집게를 사용하여 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 배설물 펠릿을 수집합니다. 튜브를 단단히 둘러싸십시오. 각 마우스에서 배설물을 수집 한 후 70 %의 에탄올로 집게를 살균한 다음 게미시달 일회용 물티슈로 멸균하십시오. 200밀리그램의 배설물 펠릿을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 0.1 밀리리터 유리 구슬을 넣고 비드 튜브를 비드 치균질균제에 넣고 실온에서 45초 동안 시료를 균질화하여 초당 4.5미터의 속도로 균일화합니다. 키트 제조업체의 지침에 따라 DNA를 추출하고 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리관에서 DNA를 엘ute하십시오. DNA를 격리한 후, 불소계에 DNA의 마이크로리터 1을 적재하여 격리된 DNA를 정량화한다. 설정 16S 리보소말 RNA 유전자 증폭 PCR1 96-Well PCR 플레이트, 25 마이크로 리터 반응 부피를 사용하여. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 40 나노 그램의 DNA, 2X 고충실도 폴리머라제 효소 믹스의 13.5 마이크로 리터, 버퍼 함유, 전방 및 역 프라이머에 DNTP를 추가합니다. PCR 플레이트를 상단에서 아래쪽으로 네 개의 가장자리를 따라 제대로 밀봉합니다. 그리고 20에서 1000 배 G에서 원심 분리기

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

연구

생물학

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

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16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

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SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

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차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

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