Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Forfatterne erkjenner finansiering fra NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust Medical Research Initiative Grant, og University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Iowa.
1. avførings sample innsamling og håndtering
<ol><li>Sterilisere skille boksene (se tabell over materialer, supplerende figur 1) med 70% etanol.</li>
	<li>Forhånds etikett mikrosentrifugen rør (én per mus) med eksempel-ID og behandlingsgruppe (hvis aktuelt).</li>
	<li>Plasser musene i sterilisert skille bokser og la dem defekt normalt i opptil 1 time.</li>
	<...

Den beskrevne protokollen er enkel, med lett-å-følge trinn for å utføre mikrobiomet profilering bruker 16S rRNA metagenomic sekvensering fra et stort antall biospecimens av interesse. Neste generasjons sekvensering har transformert mikrobiell økologi studier, spesielt i Human og pre-klinisk sykdom modeller31,32. Den største fordelen med denne teknikken er dens evne til å lykkes analysere komplekse mikrobielle komposisjoner (culturable og ikke-culturable mi...

Bakterieflora refererer til en samling av mikroorganismer (bakterier, virus, Archaea, bacteriophages, og sopp) som lever i et bestemt miljø, og mikrobiomet refererer til den kollektive Genova av bosatt mikroorganismer. Som bakterier er en av de mest tallrike mikrober hos mennesker og mus, denne studien er fokusert bare på bakteriell profilering. Den menneskelige gut er kolonisert av billioner av bakterier og hundrevis av bakterielle stammer1. Den normale gut bakterieflora spiller en viktig rolle i å opprettholde en sunn tilstand i verten ved å regulere funksjoner (dvs. vedlikehold av en intakt intestinal barriere, mat metabolisme, energi homeostase, hemming av kolonisering av patogene organismer, og regulering av immunresponser)2,3,4,5. Forstyrrelser av tarmen bakterieflora (gut dysbiosis) har vært knyttet til en rekke menneskelige sykdommer, inkludert gastrointestinale lidelser6, fedme7,8, hjerneslag9, kreft10, diabetes8,11, revmatoid artritt12, allergi13, og sentrale nervesystemet-relaterte sykdommer som multippel sklerose (MS)14,15 og Alzheimers sykdom (AD)8,16. Derfor, i de senere årene, har det vært økende interesse for verktøy for å identifisere bakteriell sammensetning på ulike kroppens nettsteder. En pålitelig metode bør ha egenskaper som å være høy gjennomstrømming og lett å bruke, har evnen til å klassifisere bakteriell bakterieflora med høy oppløsning, og å være lave kostnader.
Kultur-baserte mikrobiologisk teknikker er ikke følsomme nok til å identifisere og karakterisere den komplekse gut mikrobiomet på grunn av svikt i flere tarmbakterier å vokse i kultur. Advent av sekvensering-basert teknologi, spesielt 16S rRNA-baserte metagenomic sekvensering, har overvunnet noen av disse utfordringene og forvandlet mikrobiomet forskning17. Avansert 16S rRNA-baserte sekvensering teknologi har bidratt i å etablere en kritisk rolle for tarmen mikrobiomet i menneskers helse. The Human Mikrobiomet Project, en National Institutes of Health initiativ18, og MetaHIT prosjektet (et europeisk initiativ)19 har begge bidratt i å etablere en grunnleggende rammeverk for mikrobiomet analyse. Disse initiativene hjalp kick-starte flere studier for å bestemme hvilken rolle tarmen mikrobiomet i menneskers helse og sykdom.
En rekke grupper har vist gut dysbiosis hos pasienter med inflammatoriske sykdommer12,14,15,20,21,22. Til tross for tilværelse vidt anvendt for taksonomisk profilering på grunn av evnen å multiplex og lav omkostningene, der er nei uniform protokoller for 16S rRNA-basert taksonomisk profilering. En annen begrensning er den lave oppløsningen av taksonomisk oppdrag på grunn av mindre sekvensering leser (150 BP eller 250 BP) og bruk av bare fremover sekvensering lese (R1) på grunn av lav kvalitet omvendt sekvensering leser (R2). Men fremskritt i sekvensering teknologi har bidratt til å overvinne noen av disse utfordringene, for eksempel muligheten til å sekvens lenger leser bruker sammenkoblet-end leser (f. eks Illumina MiSeq 2x300bp).
Den nåværende sekvensering teknologien kan sekvensen 600 BP god kvalitet leser, som tillater sammenslåing av R1 og R2 leser. Disse fusjonerte lenger R1 og R2 leser tillate bedre taksonomisk oppgaver, spesielt med Open-Access R-baserte splittende Amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2) plattform. DADA2 bruker amplicon-baserte tilordninger i stedet for taksonomisk-tilordninger (OTU) basert på 97% likhet som brukes av QIIME23. ASV-kamper resulterer i en eksakt sekvens kamp i databasen innen 1 – 2 nukleotider, noe som fører til oppdrag på slekten og Arts nivå. Dermed har kombinasjonen av lengre, god kvalitet sammenkoblet-end leser og bedre taksonomisk oppdrag verktøy (for eksempel DADA2) forvandlet mikrobiomet studier.
Forutsatt her er en steg-for-steg guide for å utføre bakteriell profilering ved hjelp av to-trinns forsterkning av v3-v4 regionen 16S rRNA og dataanalyse ved hjelp av DADA2, Phyloseq, og METAGENassist rørledninger. For denne studien, Human leukocytter antigen (HLA) klasse II transgene mus brukes, som enkelte HLA klasse II alleler er koblet med en predisposisjon for autoimmune sykdommer som MS20,24,25. Men betydningen av HLA klasse II gener i å regulere sammensetningen av gut bakterieflora er ukjent. Det er hypotetisk gjennomsnitt at HLA klasse II molekylet vil påvirke gut mikrobiell samfunnet ved å velge for spesifikke bakterier. Major histocompatibility Complex (MHC) klasse II knockout mus (AE. ko) eller mus uttrykker menneskelige HLA-DQ8 molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 ble brukt for å forstå viktigheten av HLA klasse II molekyler i forme tarmen mikrobielle samfunnet. Det antas at denne komplette og forenklede arbeidsflyten med R-baserte dataanalyse vil tjene som et utmerket verktøy for forskere interessert i å utføre mikrobiomet profilering studier.
Generering av mus mangler endogene murine MHC klasse II gener (AE. KO) og AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgene mus med en C57BL/6J bakgrunn har blitt beskrevet tidligere26. Avføringsprøver er samlet fra mus av begge kjønn (8 – 12 ukers alder). Mus ble tidligere avlet og vedlikeholdt i University of Iowa dyr anlegget i henhold til NIH og institusjonelle retningslinjer. Forurensning kontroll strategier som avvenning av mus inne i en laminær Flow kabinett, endring av hansker mellom ulike stammer av mus, og riktig vedlikehold av mus er kritiske skritt for profilering av gut mikrobiomet.
Riktig personlig verneutstyr (PPE) anbefales sterkt under hele prosedyren. Passende negativ kontroller bør inkluderes når du utfører DNA-isolasjon, PCR1 og PCR2 forsterkning, og sekvensering trinn. Bruk av sterile, DNase frie, RNase frie og pyrogene forsyninger anbefales. Utpekte pipettehjelper for mikrobiomet arbeid og filtrerte pipette tips bør brukes gjennom hele protokollen. Bakterieflora analyse består av sju trinn: 1) avføringsprøve samling og prosessering; 2) utvinning av DNA; 3) 16S rRNA gen forsterkning; 4) DNA bibliotek konstruksjon ved hjelp av indeksert PCR; 5) opprydding og kvantifisering av indeksert PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; og 7) databehandling og sekvens analyse. Et skjematisk diagram over alle protokoll trinnene er vist i figur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

Den menneskelige gut er kolonisert av billioner av bakterier som støtter fysiologiske funksjoner som mat metabolisme, energihøsting, og regulering av immunsystemet. Forstyrrelsene av sunne gut mikrobiomet har blitt foreslått å spille en rolle i utviklingen av inflammatoriske sykdommer, inkludert multippel sklerose (MS). Miljømessige og genetiske faktorer kan påvirke sammensetningen av mikrobiomet; Derfor identifisering av mikrobielle samfunn knyttet til en sykdom fenotype har blitt det første skrittet mot å definere mikrobiomet rolle i helse og sykdom. Bruk av 16S rRNA metagenomic sekvensering for profilering bakteriell samfunnet har bidratt i fremmarsj mikrobiomet forskning. Til tross for bred bruk, er det ingen enhetlig protokoll for 16S rRNA-baserte taksonomisk profilering analyse. En annen begrensning er det lav resolution av taksonomisk vervet på grunn av teknisk vanskeligheter som mindre sekvensering leser, likeledes idet bruk av bare videresende (R1) leser inne det final analyse på grunn av lav kvalitet av det omvendte (R2) leser. Det er behov for en forenklet metode med høy oppløsning for å karakterisere bakteriell mangfold i en gitt biospecimen. Fremskritt i sekvensering teknologi med evnen til sekvensen lengre leser i høy oppløsning har bidratt til å overvinne noen av disse utfordringene. Present sekvensering teknologi kombinert med en offentlig tilgjengelig metagenomic analyse rørledning som R-basert splittende Amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2) har bidratt til å fremme mikrobiell profilering ved høy oppløsning, som DADA2 kan tildele sekvens på slekten og arter nivåer. Beskrevet her er en guide for å utføre bakteriell profilering ved hjelp av to-trinns forsterkning av v3-v4 regionen av 16S rRNA genet, etterfulgt av analyse ved hjelp av fritt tilgjengelige analyseverktøy (dvs. DADA2, Phyloseq, og METAGENassist). Det antas at denne enkle og komplette arbeidsflyten vil tjene som et utmerket verktøy for forskere interessert i å utføre mikrobiomet profilering studier.

Som MHC klasse II molekyler (HLA hos mennesker) er sentrale aktører i adaptive immunrespons og vise sterke assosiasjoner med en predisposisjon for MS24,25,26, var det hypotetisk gjennomsnitt at HLA klasse II molekyl ville påvirke gut mikrobiell komposisjon. Derfor mus mangler MHC klasse II genet (AE. KO) eller uttrykke menneskelige HLA-DQ8 genet (HLA-DQ8) ble benyttet for å forstå viktigheten av HLA klasse II molekyler i utf...

Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Beskrevet her er en forenklet standard driftsprosedyre for mikrobiomet profilering bruker 16S rRNA metagenomic sekvensering og analyse ved hjelp av fritt tilgjengelige verktøy. Denne protokollen vil hjelpe forskere som er nye til mikrobiomet feltet så vel som de som krever oppdateringer på metoder for å oppnå bakteriell profilering på en høyere oppløsning.

Bakterieflora analyse ved hjelp av to-trinns PCR og neste generasjons 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Profilering av mikrobiome er det første skrittet mot å definere mikrobiomets rolle i helse og sykdom. Her beskriver vi en enkel prosedyre for å isolere bakteriell DNA av høy kvalitet fra fekal prøveforberedende bibliotek, utføre 16SR RNA og en meta genomisk sekvensering og mikrobiome dataanalyse. Denne protokollen vil hjelpe forskere nye til mikrobiome feltet, samt forskere som arbeider i mikrobiome feltet i å etablere mikrobiome rørledningen i laboratoriet. Denne protokollen kan utvides for profilering av mikrobiome fra andre bioprøver som nese-, munn- eller hudprøver av dyre- og menneskepersoner. Perleplukking er de viktigste trinnene da alle nedstrøms trinn er avhengige av DNA av høy kvalitet. Riktig forsegling av bevaringsplaten er viktig da ufullstendig tetning kan føre til undertrykkelse av forsterket produkt, noe som resulterer i sekvenseringsdata av lav kvalitet. For å begynne, steriliser skilleboksene med 70% etanol. Plasser musene i steriliserte skilleveggbokser og la dem avlede normalt i opptil en time. Bruk sterile tang til å samle de fekale pellets i en tom pre-merket 1,5 milliliter mikro sentrifuge rør. Fest røret godt. Steriliser tangen med 70% etanol, etterfulgt av en bakteriedrepende engangsserviett, etter å ha samlet fekal fra hver mus. Vei 200 milligram fekal pellets i en 1,5 milliliter mikro sentrifuge rør, med 0,1 milliliter glass perler, og plasser perlerøret i en perle som slår homogenisator og homogenisere prøvene i 45 sekunder ved romtemperatur, med en hastighet på 4,5 meter per sekund. Trekk ut DNA i henhold til instruksjonene fra kit produsenten og elute DNA i en 1,5 milliliter mikro sentrifuge rør. Etter å ha isolert DNA, kvantifisere det isolerte DNA ved å laste 1 mikroliter av DNA på et fluorometer. Oppsett 16S ribosomal RNA genforsterkning PCR1 i en 96-brønns PCR-plate, ved hjelp av et 25 mikroliter reaksjonsvolum. Bruk en flerkanals pipette, tilsett 40 nano gram DNA, 13,5 mikro liter 2X high-fidelity polymerase enzymblanding, som inneholder buffer, pluss DNTPs fremover og omvendt primer. Forsegle PCR-platen riktig fra toppen til bunnen i langs alle fire kantene. Og sentrifuge ved 1000 ganger G ved 20

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og neste generasjons sekvensering: Nyttige verktøy for identifikasjon av gener involvert i Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Neste-generasjons sekvensering av 16S ribosomalt RNA Gene amplikonene

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Målrettet DNA Metylering Analyse av Neste-generasjons sekvense

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effektiv Nucleic Acid Utvinning og 16S rRNA Gene Sekvense for Bakteriell Fellesskapet Karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Guidet protokoll for Fecal mikrobiell karakterisering av 16S rRNA-Amplicon sekvenser

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: En protokoll for Domainome biblioteket konstruksjon, validering og utvalg av Phage Display og neste generasjons sekvensering

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Tick Microbiome karakterisering av neste generasjons 16S rRNA Amplicon sekvenser

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

To-trinns omvendt transkripsjon dråpe digitale PCR-protokoller for SARS-CoV-2 deteksjon og kvantifisering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

En magnetisk-perle-basert mygg DNA-ekstraksjonsprotokoll for neste generasjons sekvensering

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...