Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Os autores reconhecem o financiamento do NIAID/NIH (1R01AI137075-01), o Carver Trust Medical Research Initiative Grant, e do centro de pesquisa de ciências ambientais de saúde da Universidade de Iowa, NIEHS/NIH (p30 ES005605).

O protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Iowa.
1. coleta e manuseio de amostras fecais
<ol><li>Esterilizar as caixas divisórias (ver tabela de materiais, Figura complementar 1) com 70% de etanol.</li>
	<li>Pré-rótulo de tubos de microcentrífuga (um por mouse) com o ID de amostra e grupo de tratamento (se aplicável).</li>
	<li>Coloc os ratos em umas caixas esterilizadas do divisor e permita que d...

O protocolo descrito é simples, com etapas fáceis de seguir para executar o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica de 16s rRNA de um grande número bioespécimes do interesse. O sequenciamento da próxima geração transformou estudos de ecologia microbiana, especialmente em modelos de doenças humanas e pré-clínicas31,32. A principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de analisar com sucesso composições microbianas comple...

A microbiota refere-se a uma coleção de microrganismos (bactérias, vírus, archaea, bacteriófagos e fungos) vivendo em um ambiente particular, e o microbioma refere-se ao genoma coletivo de microrganismos residentes. Como as bactérias são um dos micróbios mais abundantes em humanos e camundongos, este estudo é focado apenas no perfil bacteriano. O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias e centenas de cepas bacterianas1. A microbiota intestinal normal desempenha um papel vital na manutenção de um estado saudável no hospedeiro, regulando as funções (ou seja, a manutenção de uma barreira do intestino intacto, metabolismo alimentar, homeostase energética, inibição da colonização por organismos patogénicos, e regulação das respostas imunes)2,3,4,5. As perturbações composicional da microbiota intestinal (disbiose intestinal) têm sido ligadas a uma série de doenças humanas, incluindo distúrbios gastrointestinais6, obesidade7,8, acidentevascular cerebral9, câncer10, diabetes8,11, artrite reumatóide12, alergias13, e doenças relacionadas ao sistema nervoso central, tais como esclerose múltipla (MS)14,15e Alzheimer doença (AD)8,16. Portanto, nos últimos anos, tem havido crescente interesse em ferramentas para identificar a composição bacteriana em diferentes locais do corpo. Um método confiável deve ter características como ser de alta produtividade e fácil de usar, ter a capacidade de classificar a microbiota bacteriana com alta resolução, e ser de baixo custo.
Técnicas microbiológicas baseadas na cultura não são sensíveis o suficiente para identificar e caracterizar o complexo microbioma intestinal devido à falha de várias bactérias intestinais para crescer na cultura. O advento da tecnologia baseada em sequenciamento, especialmente o seqüenciamento metagenomico baseado em rRNA 16s, superou alguns desses desafios e transformou a pesquisa em microbioma17. A avançada tecnologia de sequenciamento 16S rRNA tem ajudado a estabelecer um papel crítico para o microbioma intestinal na saúde humana. O projeto do microbioma humano, uma iniciativa nacional dos institutos de saúde18, e o projeto metahit (uma iniciativa européia)19 ajudaram a estabelecer um quadro básico para a análise do microbioma. Essas iniciativas ajudaram a iniciar vários estudos para determinar o papel do microbioma intestinal na saúde humana e na doença.
Vários grupos demonstraram disbiose intestinal em pacientes com doenças inflamatórias12,14,15,20,21,22. Apesar de ser amplamente utilizado para o perfilamento taxonômico devido à capacidade de multiplex e de baixos custos, não há nenhum protocolo uniforme para o perfilamento taxonômico 16S rRNA-baseado. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido às leituras de seqüenciamento menores (150 BP ou 250 BP) e o uso de apenas seqüenciamento de encaminhamento lido (R1) devido a leituras de seqüenciamento reverso de baixa qualidade (R2). No entanto, os avanços na tecnologia de sequenciamento ajudaram a superar alguns desses desafios, como a capacidade de sequenciar leituras mais longas usando leituras de extremidade emparelhada (por exemplo, Illumina MiSeq 2x300bp).
A tecnologia de sequenciamento atual pode sequenciar 600 BP leituras de boa qualidade, que permite a mesclagem de leituras R1 e R2. Essas leituras de R1 e R2 mais longas mescladas permitem melhores atribuições taxonômicas, especialmente com a plataforma de acesso livre com base em R divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2). DADA2 utiliza atribuições baseadas em variante de sequência de amplicon (ASV) em vez de atribuições de unidade taxonômica operacional (OTU) com base na similaridade de 97% utilizada pelo QIIME23. As correspondências do ASV resultam em uma correspondência exata de sequência no banco de dados dentro de 1 a 2 nucleotídeos, o que leva à atribuição em níveis de gênero e espécie. Assim, a combinação de leituras mais longas, de boa qualidade pareadas e melhores ferramentas de atribuição taxonômica (como DADA2) transformaram estudos de microbioma.
Fornecido aqui é um guia passo-a-passo para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 de rRNA 16S e análise de dados usando DADA2, Phyloseq e METAGENassist pipelines. Para este estudo, os camundongos transgênicos de classe II de Antígeno leucocitário humano (HLA) são usados, pois certos alelos HLA classe II estão vinculados a uma predisposição a doenças auto-imunes, como a MS20,24,25. Entretanto, a importância de genes da classe II de HLA em regular a composição da microbiota do intestino é desconhecida. Hipótese que a molécula da classe II de HLA influenciará a comunidade microbiana do intestino selecionando para bactérias específicas. Os camundongos Knockout de classe II (AE. ko) ou camundongos que expressam moléculas HLA-DQ8 humanas (HLA-DQ8)24,25,26 foram usados para compreender a importância das moléculas HLA classe II em moldar a comunidade microbiana do intestino. Acredita-se que este fluxo de trabalho completo e simplificado com análise de dados baseada em R servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.
A geração de camundongos que faltam genes de classe II Murina endógena de MHC (AE. KO) e AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * (HLA-DQ8) camundongos transgênicos com um fundo C57BL/6J tem sido descrito anteriormente26. Amostras fecais são coletadas de camundongos de ambos os sexos (8 – 12 semanas de idade). Os camundongos foram previamente criados e mantidos na instalação animal da Universidade de Iowa de acordo com o NIH e as diretrizes institucionais. Estratégias de controle de contaminação, como o desmame dos camundongos dentro de um armário de fluxo laminar, a mudança de luvas entre diferentes cepas de camundongos, e a manutenção adequada de camundongos são passos críticos para o perfilamento do microbioma intestinal.
O equipamento de proteção individual (EPI) adequado é altamente recomendado durante todo o procedimento. Controles negativos apropriados devem ser incluídos na realização de isolamento de DNA, amplificação PCR1 e PCR2 e etapas de sequenciamento. Recomenda-se o uso de suprimentos estéreis, livres de DNase, RNase e sem Pirogênios. O pipetador designado para o trabalho do microbioma e as pontas filtradas da pipeta devem ser usados durante todo o protocolo. A análise da microbiota consiste em sete etapas: 1) coleta e processamento de amostras fecais; 2) extração de DNA; 3) amplificação do gene 16S rRNA; 4) construção da biblioteca do ADN usando o PCR indexado; 5) limpeza e quantificação de PCR indexada (biblioteca); 6) sequenciamento de MiSeq; e 7) processamento de dados e análise de sequências. Um diagrama esquemático de todas as etapas do protocolo é mostrado na Figura 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias que suportam funções fisiológicas, tais como metabolismo alimentar, colheita de energia, e regulação do sistema imunológico. A perturbação do microbioma intestinal saudável tem sido sugerida para desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias, incluindo esclerose múltipla (MS). Fatores ambientais e genéticos podem influenciar a composição do microbioma; Portanto, a identificação de comunidades microbianas ligadas a um fenótipo de doença tornou-se o primeiro passo para a definição do papel do Microbiome na saúde e na doença. O uso do sequenciamento metagenomico de 16s rRNA para analisar a comunidade bacteriana tem ajudado no avanço da pesquisa de microbioma. Apesar de seu uso largo, não há nenhum protocolo uniforme para a análise de perfilação taxonômica 16S rRNA-baseada. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido a dificuldades técnicas, como leituras de sequenciamento menores, bem como o uso de apenas leituras Forward (R1) na análise final devido à baixa qualidade de leituras inversas (R2). Há necessidade de um método simplificado com alta resolução para caracterizar a diversidade bacteriana em um dado bioespécime. Os avanços na tecnologia de sequenciamento com a capacidade de sequenciar leituras mais longas em alta resolução ajudaram a superar alguns desses desafios. A tecnologia de sequenciamento atual combinada com um pipeline de análise metagenômica disponível publicamente, como o R-based divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2), ajudou a avançar o perfil microbiano em alta resolução, pois DADA2 pode atribuir a sequência no gênero e níveis de espécies. Descrito aqui é um guia para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 do gene 16S rRNA, seguido pela análise usando ferramentas de análise disponíveis livremente (i.e., DADA2, Phyloseq, e METAGENassist). Acredita-se que este fluxo de trabalho simples e completo servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.

Como as moléculas da classe II de MHC (HLA nos seres humanos) são os jogadores centrais na resposta imune adaptativa e mostram associações fortes com uma predisposição a MS24,25,26, foi supor que a molécula da classe II de HLA influenciaria a composição microbiana do intestino. Conseqüentemente, os ratos que faltam o gene da classe II de MHC (AE. KO) ou expressando o gene humano de HLA-DQ8 (HLA-DQ8) foram utilizados pa...

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Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

O perfil do microbioma é o primeiro passo para definir o papel do microbioma na saúde e na doença. Aqui, estamos descrevendo um procedimento simples para isolar o DNA bacteriano de alta qualidade da biblioteca de preparação de amostras fecais, realizando rna 16SR e uma análise de dados meta genômicos e microbiomas. Este protocolo ajudará pesquisadores novos no campo do microbioma, bem como pesquisadores que trabalham no campo do microbioma no estabelecimento do gasoduto de microbioma em seu laboratório. Este protocolo pode ser estendido para o perfil do microbioma de outros biobiomas, como amostras nasais, orais ou de pele de indivíduos animais e humanos. A colheita de contas é o passo mais importante, pois todos os passos a jusante dependem de DNA de alta qualidade. A vedação adequada da placa de preservação é importante, pois a vedação incompleta pode levar ao oprimimento do produto amplificado, resultando em dados de sequenciamento de baixa qualidade. Para começar, esterilize as caixas divisoras com 70% de etanol. Coloque os ratos em caixas de divisor esterilizadas e deixe-os defecar normalmente por até uma hora. Use fórceps estéreis para coletar as pelotas fecais em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro vazio pré-rotulado. Inclua o tubo com segurança. Esterilize os fórceps com 70% de etanol, seguido de um extrato germicidal descartável, após a coleta de fecal de cada rato. Pesar 200 miligramas de pelotas fecais em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro, com contas de vidro de 0,1 mililitro, e colocar o tubo de contas em um homogeneizador de contas e homogeneizar as amostras por 45 segundos à temperatura ambiente, a uma velocidade de 4,5 metros por segundo. Extrair DNA de acordo com as instruções do fabricante do kit e DNA elute em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro. Depois de isolar o DNA, quantifique o DNA isolado carregando 1 microliter do DNA em um fluorômetro. Configuração 16S repartição do gene RNA PCR1 em uma placa PCR de 96-Well, usando um volume de reação de 25 microliter. Usando uma pipeta multicanal, adicione 40 nano gramas de DNA, 13,5 micro litros de mistura de enzimas de polimerase de alta fidelidade 2X, contendo tampão, além de DNTPs no primer dianteiro e reverso. Sele a placa PCR corretamente da parte superior até a parte inferior ao longo de todas as quatro bordas. E centrífuga a 1000 vezes G em 20

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