Name: microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Författarna erkänner finansiering från NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust medicinsk forskning initiativ Grant, och University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Protokollet godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommitté vid University of Iowa.
1. insamling och hantering av fekal prov
<ol><li>Sterilisera avdelare lådor (se tabell över material, kompletterande figur 1) med 70% etanol.</li>
	<li>Pre-Label mikrocentrifug rör (en per mus) med provet ID och behandlingsgrupp (om tillämpligt).</li>
	<li>Placera mössen i steriliserade avdelare lådor och låt dem att uträtta sina behov normalt f...

Det beskrivna protokollet är enkelt, med lätt att följa steg för att utföra mikrobiomet profilering med 16s rRNA potenta sekvensering från ett stort antal biospecimen av intresse. Nästa generations sekvensering har förändrat mikrobiella ekologi studier, särskilt i humana och prekliniska sjukdomsmodeller31,32. Den största fördelen med denna teknik är dess förmåga att framgångsrikt analysera komplexa mikrobiella kompositioner (culturable och icke-cu...

Microbiota hänvisar till en samling av mikroorganismer (bakterier, virus, Archaea, bakteriofages, och svampar) som lever i en viss miljö, och mikrobiomet hänvisar till det kollektiva genomet av inhemska mikroorganismer. Eftersom bakterier är en av de vanligast förekommande mikroberna hos människor och möss är denna studie endast inriktad på bakterie profilering. Den mänskliga tarmen är koloniserad av biljoner bakterier och hundratals bakteriestammar1. Den normala tarmfloran spelar en viktig roll för att upprätthålla en hälsosam tillstånd i värden genom att reglera funktioner (dvs., underhåll av en intakt tarm barriär, mat metabolism, energi homeostas, hämning av koloniseringen av patogena organismer, och reglering av immunsvar)2,3,4,5. Kompositionella störningar i tarmfloran (Gut dysbios) har kopplats till ett antal mänskliga sjukdomar, inklusive gastrointestinala sjukdomar6, fetma7,8, stroke9, cancer10, diabetes8,11, reumatoid artrit12, allergier13, och centralanervsystemet-relaterade sjukdomar såsom multipel skleros (MS)14,15 och Alzheimers sjukdom (AD)8,16. Därför har det under de senaste åren funnits ett växande intresse för verktyg för att identifiera bakterie sammansättningen på olika kropps platser. En tillförlitlig metod bör ha egenskaper såsom hög genomströmning och lätt att använda, med möjlighet att klassificera bakteriell bakterieflora med hög upplösning, och att vara låg kostnad.
Kulturbaserade mikrobiologiska tekniker är inte tillräckligt känsliga för att identifiera och karakterisera den komplexa tarmfloran på grund av att flera tarmbakterier har misslyckats med att växa i kulturen. Tillkomsten av sekvenserings-baserad teknik, särskilt 16s rRNA-baserade potenta sekvensering, har övervunnit några av dessa utmaningar och omvandlas mikrobiomet forskning17. Avancerad 16s rRNA-baserade sekvenserings teknik har bidragit till att etablera en kritisk roll för Gut mikrobiomet i människors hälsa. Den mänskliga mikrobiomet Project, en National Institutes of Health initiativ18, och metahit projektet (ett europeiskt initiativ)19 har båda bidragit till att upprätta en grundläggande ram för mikrobiomet analys. Dessa initiativ bidrog till att kickstarta flera studier för att fastställa den roll som Gut mikrobiomet i människors hälsa och sjukdom.
Ett antal grupper har visat tarm dysbios hos patienter med inflammatoriska sjukdomar12,14,15,20,21,22. Trots att de ofta används för taxonomisk profilering på grund av förmågan att multiplex och låga kostnader, det finns inga enhetliga protokoll för 16S rRNA-baserade taxonomisk profilering. En annan begränsning är den låga upplösningen av taxonomisk tilldelning på grund av mindre sekvensering läsningar (150 BP eller 250 BP) och användning av endast framåt sekvensering läsa (R1) på grund av låg kvalitet omvänd sekvensering läsningar (R2). Framsteg inom sekvenserings teknik har dock bidragit till att övervinna några av dessa utmaningar, till exempel möjligheten att sekvensera längre läsningar med Parade-end läsningar (t. ex., Illumina MiSeq 2x300bp).
Den nuvarande sekvenserings teknik kan sekvens 600 BP god kvalitet läser, som tillåter sammanslagning av R1 och R2 läsningar. Dessa sammanslagna längre R1 och R2 läsningar tillåta bättre taxonomiska tilldelningar, särskilt med Open-Access R-baserade Divisive amplicon denoising algoritm-2 (DADA2) plattform. DADA2 använder amplikon Sequence variant (ASV)-baserade uppdrag i stället för operativa taxonomiska enhet (OTU) uppdrag baserat på 97% likhet utnyttjas av qiime23. ASV-matcher resulterar i en exakt sekvens matchning i databasen inom 1 – 2 nukleotider, vilket leder till tilldelning på genus och artnivåer. Sålunda, kombinationen av längre, god kvalitet Parade-end läsningar och bättre taxonomiska tilldelnings verktyg (såsom DADA2) har förändrat mikrobiomet studier.
Tillhandahålls här är en steg-för-steg-guide för att utföra bakteriell profilering med två steg förstärkning av v3-v4 regionen 16S rRNA och dataanalys med hjälp av DADA2, Phyloseq, och METAGENassist pipelines. För denna studie används humana leukocytantigen (HLA) klass II-transgena möss, eftersom vissa HLA-klass II-alleler är kopplade till en predisposition för autoimmuna sjukdomar som MS20,24,25. Emellertid, betydelsen av HLA klass II gener i regleringen av sammansättningen av Gut bakterieflora är okänd. Det är en hypotes om att HLA klass II-molekylen kommer att påverka tarmmikrobiell gemenskap genom att välja för specifika bakterier. Större histocompatibility complex (MHC) klass II knockout-möss (AE. ko) eller möss som uttrycker humana HLA-DQ8-molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 användes för att förstå betydelsen av HLA-klass II-molekyler i forma tarmfloran. Man tror att detta kompletta och förenklade arbetsflöde med R-baserad dataanalys kommer att fungera som ett utmärkt verktyg för forskare intresserade av att utföra mikrobiomet profilering studier.
Generering av möss som saknar endogena murina MHC klass II-gener (AE. KO) och AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgena möss med en C57BL/6J bakgrund har beskrivits tidigare26. Fekal prover samlas in från möss av båda könen (8 – 12 veckors ålder). Möss har tidigare fötts upp och underhålls i University of Iowa djur anläggning enligt NIH och institutionella riktlinjer. Strategier för föroreningskontroll såsom avvänjning av möss i ett laminärt flödes skåp, byte av handskar mellan olika möss stammar och korrekt underhåll av möss är kritiska steg för profilering av tarmmikrobiomen.
Lämplig personlig skyddsutrustning rekommenderas starkt under hela proceduren. Lämpliga negativa kontroller bör inkluderas när du utför DNA-isolering, PCR1 och PCR2 amplifiering och sekvenserings steg. Användning av sterila, DNase-fri, RNase-fri, och pyrogenfria leveranser rekommenderas. En särskild multikanalspipettor för mikrobiomet arbete och filtrerade pipettspetsar bör användas i hela protokollet. Microbiota analys består av sju steg: 1) fekal provinsamling och bearbetning; 2) extraktion av DNA; 3) 16S rRNA genamplifiering; 4) DNA-biblioteksbyggande med indexerad PCR; 5) sanering och kvantifiering av indexerad PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; och 7) databehandling och sekvensanalys. Ett Schematiskt diagram över alla protokoll steg visas i figur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Natural Microcentriguge Tube</td>
			<td>USA, Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M hand applicator squeegee PA1-G</td>
			<td>3M, MN, US</td>
			<td>7100038651</td>
			<td>Squeeger for proper sealing of PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>A63880</td>
			<td>PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 REAGENT</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer DNA 1000 chip</td>
			<td>Agilent Technologies, CA, USA</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA quantification and quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Adopter Replacement Caps</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>15026762</td>
			<td>New cap for Index 1 and 2 adopter primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td>
			<td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystem, MA, USA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Divider Boxes</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>ND03080</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>New England BioLabs, MA, USA</td>
			<td>S1509S</td>
			<td>For PCR clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4346906</td>
			<td>PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>4311971</td>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td>B30154</td>
			<td>Centrifuge used for DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>For MiSeq Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>16S rRNA DNA Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs Multichannel Trays</td>
			<td>ASI, FL,USA</td>
			<td>RS71-1</td>
			<td>For Pooling of PCR2 Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Cetrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>75004393</td>
			<td>For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>For MiSeq Sequencing control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiome DNA Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>A29789</td>
			<td>For purification of PCR1 product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>Omni International, GA, USA</td>
			<td>19-001</td>
			<td>Bead beater for DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Index Plate Fixture</td>
			<td>Illumina, Inc., CA, USA</td>
			<td>FC-130-1005</td>
			<td>For Arranging of the index primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (large)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-2280</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Dividers (small)</td>
			<td>Lewis Bins, WI, US</td>
			<td>DV-1780</td>
			<td>Fecal collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiota analysis using two-step pcr and next-generation 16s rrna gene sequencing

Den mänskliga tarmen är koloniserad av biljoner bakterier som stöder fysiologiska funktioner såsom mat metabolism, energi skörd, och reglering av immunförsvaret. Störning av den friska tarmen mikrobiomet har föreslagits att spela en roll i utvecklingen av inflammatoriska sjukdomar, inklusive multipel skleros (MS). Miljömässiga och genetiska faktorer kan påverka sammansättningen av mikrobiomen; Därför har identifiering av mikrobiella samhällen kopplade till en sjukdoms fenotyp blivit det första steget mot att definiera microbiome roll i hälsa och sjukdom. Användning av 16s rRNA potenta sekvensering för profilering bakteriell samfundet har bidragit till att främja mikrobiomet forskning. Trots sin breda användning, det finns inget enhetligt protokoll för 16S rRNA-baserade taxonomiska profilering analys. En annan begränsning är den låga upplösningen av taxonomisk tilldelning på grund av tekniska svårigheter såsom mindre sekvensering läsningar, samt användning av endast framåt (R1) läser i den slutliga analysen på grund av låg kvalitet på omvänd (R2) läsningar. Det finns behov av en förenklad metod med hög upplösning för att karakterisera bakterie mångfalden i ett givet bio prov. Framsteg i sekvensering teknik med förmågan att sekvens längre läsningar med hög upplösning har bidragit till att övervinna några av dessa utmaningar. Nuvarande sekvenserings teknik i kombination med en allmänt tillgänglig metagenomisk analyspipeline som R-baserad Divisive Amlicon denoising algoritm-2 (DADA2) har hjälpt till att främja mikrobiell profilering med hög upplösning, eftersom DADA2 kan tilldela sekvens på släktet och artnivåer. Beskrivs här är en guide för att utföra bakteriell profilering med hjälp av två steg förstärkning av v3-v4 regionen av 16S rRNA genen, följt av analys med fritt tillgängliga analysverktyg (dvs., DADA2, Phyloseq, och METAGENassist). Man tror att detta enkla och kompletta arbetsflöde kommer att fungera som ett utmärkt verktyg för forskare intresserade av att utföra mikrobiomet profilering studier.

Som MHC klass II molekyler (HLA hos människor) är centrala aktörer i den adaptiva immunförsvaret och Visa starka associationer med en anlag till MS24,25,26, det var en hypotes om att HLA klass II-molekylen skulle påverka tarmens mikrobiella sammansättning. Därför har möss som saknar genen MHC class II (AE. KO) eller uttryckt humant HLA-DQ8-genen (HLA-DQ8) utnyttjats för att förstå betydelsen av HLA-klass II-molekyler...

Watch this Scientific Journal Video about Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing at JoVE.com

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Beskrivs här är en förenklad standard operativ förfarande för mikrobiomet profilering med 16s rRNA potenta sekvensering och analys med hjälp av fritt tillgängliga verktyg. Detta protokoll kommer att hjälpa forskare som är nya på mikrobiomet fältet samt de som kräver uppdateringar om metoder för att uppnå bakteriell profilering med en högre upplösning.

Microbiota analys med två steg PCR och nästa generations 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Profilering av mikrobiomet är det första steget mot att definiera mikrobiomets roll i hälsa och sjukdom. Här beskriver vi ett enkelt förfarande för att isolera högkvalitativt bakterie-DNA från fekalt prov förbereder bibliotek, utför 16SR RNA och en metagenomisk sekvensering och mikrobiomet dataanalys. Detta protokoll kommer att hjälpa forskare nya till mikrobiomet området, samt forskare som arbetar i mikrobiomet området för att etablera mikrobiomet rörledningen i deras labb. Detta protokoll kan utvidgas för profilering av mikrobiomet från andra bio exemplar såsom nasala, muntliga, eller hudprover av djur och människor ämnen. Bead plockning är de viktigaste stegen som alla nedströms steg är beroende av hög kvalitet DNA. Korrekt tätning av bevara plattan är viktigt som ofullständig tätning kan leda till förtryck av förstärkt produkt som resulterar i låg kvalitet sekvensering data. Till att börja med sterilisera avdelare lådor med 70%etanol. Placera mössen i steriliserade avdelare lådor och låt dem defecate normalt i upp till en timme. Använd sterila tövråkar för att samla upp fekalpelletsen i ett tomt förmörkas 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Omslut röret säkert. Sterilisera tången med 70%etanol, följt av en germicidal engångstork, efter att ha samlat fekal från varje mus. Väg 200 milligram fekal pellets i en 1,5 milliliter mikro centrifugrör, med 0,1 milliliter glaspärlor, och placera pärlröret i en pärla slå homogenisator och homogenisera proverna i 45 sekunder vid rumstemperatur, med en hastighet av 4,5 meter per sekund. Extrahera DNA enligt instruktioner från kittillverkaren och elute DNA i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Efter att ha isolerat DNA kvantifiera det isolerade DNA:t genom att ladda 1 mikroliter av DNA:t på en fluorometer. Setup 16S ribosomal RNA genförstärkning PCR1 i en 96-Well PCR-platta, med hjälp av en 25 mikroliter reaktionsvolym. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 40 nano gram DNA, 13,5 mikro liter 2X high-fidelity polymeras enzym mix, som innehåller buffert, plus DNTPs i framåt och omvänd primer. Täta PCR-plattan ordentligt från toppen till botten in längs alla fyra kanterna. Och centrifugera vid 1000 gånger G vid 20

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening och nästa generations sekvensering: Användbara verktyg för identifiering av gener involverade i Organell Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Nästa generations sekvensering av 16S ribosom RNA Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Riktade DNA-metylering analys av Nästa generations sekvense

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effektiv Nucleic Acid Extraction och 16S rRNA gensekvenser för bakteriell Community karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Guidade protokoll för fekal mikrobiell karakterisering av 16S rRNA-amplikon sekvensering

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Ett protokoll för Domainome bibliotek konstruktion, validering och urval av Phage Display och nästa generations sekvensering

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Tickande mikrobiomet karakterisering av nästa generations 16S rRNA amplikon sekvensering

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tvåstegs omvänd transkriptionsdroppe digitala PCR-protokoll för SARS-CoV-2-detektering och kvantifiering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Ett magnetiskt pärlbaserat mygg-DNA-extraktionsprotokoll för nästa generations sekvensering

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...