Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

ونحن ممتنون لمعهد البحوث الصحية الشمس راية الدماغ والجسم برنامج التبرع (BBDP) من صن سيتي, ولاية اريزونا لتوفير انسجه المخ البشرية. وقد تم دعم BBDP من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (U24 NS072026 الوطنية الدماغ والانسجه الموارد لمرض باركنسون والاضطرابات ذات الصلة) ، المعهد الوطني للشيخوخة (P30AG19610 اريزونا مرض الزهايمر مركز الاساسيه), ولاية اريزونا قسم الخدمات الصحية (عقد 211002, اريزونا مركز البحوث الزهايمر), ولاية اريزونا لجنه البحوث الطبية الحيوية (عقود 4001, 0011, 05-901 و 1001 إلى اتحاد مرض باركنسون في ولاية اريزونا) ومايكل J. مؤسسه فوكس للبحوث باركنسون27. وقد دعمت هذه الدراسة أيضا من قبل وزاره التعليم الوطني وولاية اريزونا (ADHS منحه # ADHS14-052688). كما نشكر أندريا شميت (بحث بانر) وسينثيا ليهوغا (TGen) للدعم الإداري.

وقد اجري هذا البحث امتثالا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان. وقد تم الحصول علي انسجه المخ من برنامج التبرع بالمخ والجسم لمعهد البحوث الصحية في صن سيتي ، AZ. وتتم الموافقة علي عمليات برنامج التبرع بالمخ والجسم من قبل مجلس المراجعة المؤسسية الغربية (بروتوكول ...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).</li><li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

وفي هذه الدراسة ، تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبات المتاحة تجاريا ، وخيارات ما قبل المعالجة ، وكميات الحمض الريبي للإدخال من أجل تحسين بروتوكول إثراء circRNA لبناء مكتبات تسلسل circRNA. واستنادا إلى تقييمات هذه الدراسة ، فان عددا من الجوانب الرئيسية والخطوات الحاسمة في إنشاء مكتبات ...

التعميم rnas (circrnas) هي الذاتية ، وغير الترميز rnas التي اكتسبت الاهتمام نظرا لتعبيرها المتفشي في الناسخة النواة1،2،3. يتم تشكيلها عندما الاكسون العودة لصق لبعضها البعض ، التالي اعتبرت في البداية ان تكون التحف الربط4،5. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات الاخيره ان circrnas المعرض نوع الخلية ، والانسجه ، والتنمية المرحلة المحددة التعبير3،6 ويتم الحفاظ علي التطور2،3. وعلاوة علي ذلك ، فهي تشارك في الوساطة من البروتين والبروتين التفاعلات7، الصغرى الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) ملزمه3،8،9،10، وتنظيم النسخ الجيني الابويه11.
في تسلسل RNA الكلاسيكية (الحمض الريبي النيبالي-seq) ، circRNAs قد تكون فقدت تماما اثناء بناء المكتبة نتيجة لاختيار بولي-A ل mRNAs أو قد يكون من الصعب عزل نظرا لوفره منخفضه. ومع ذلك ، فقد أدرجت الدراسات الحديثة لتوصيف الخصائص خطوه ما قبل المعالجة باستخدام rnase R من أجل إثراء circrna2،12،13. RNase R هو اكسوريبونوكليسي التي يهضم RNAs الخطية ، تاركا وراءها هياكل الحمض الريبي النيبالي الدائري. تم تحسين بروتوكولات التخصيب CircRNA عن طريق توليد ومقارنه البيانات من اثنين المتاحة تجاريا مجموعات البناء مكتبه النسخ ، مع وبدون خطوه RNase R قبل العلاج ، واستخدام كميات متفاوتة من الدخل الكلي RNA (1 إلى 4 ميكروغرام). وكان البروتوكول الأمثل تستخدم المقبل لتقييم وفره من circRNAs عبر خمس مناطق الدماغ المختلفة (المخيخ [BC] ، الفص الجداري السفلي [الملكية الفكرية] ، الجيروسكوب الصدغي الأوسط [MG] ، القشرة القذالي [OC] والجيروسكوب الامامي المتفوق [SF]) وأربعه أنواع أخرى من الانسجه (الكبد [LV] ، الرئة [LU] ، العقدة الليمفاوية [LN] والبنكرياس [PA]). وكانت المكتبات التي تليها الحمض الريبي النيبالي-المتسلسلة المتعاقبة وتحليل البيانات باستخدام سته مختلفه خوارزميات التنبؤ circRNA: find_circ3، ciri14، mapsplice15، سكين16، dcc17، و سيرسيكسبلورير18. واستنادا إلى تحليلنا ، تم الكشف عن أكبر عدد من circRNAs فريدة من نوعها عند استخدام مجموعه من الذين تقطعت بهم السبل اعداد مكتبه الحمض الريبي النيبالي مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام إجمالي المدخلات RNA. يتم وصف البروتوكول الأمثل هنا. كما ذكر سابقا19,20, لوحظ اعلي إثراء من circrnas في الدماغ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

التعميم RNAs (circRNAs) هي فئة من غير الترميز RNAs المشاركة في وظائف بما في ذلك مايكرو الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) التنظيم ، والوساطة من التفاعلات بروتين البروتين ، وتنظيم النسخ الجيني الابويه. في الجيل التالي الكلاسيكية RNA تسلسل (RNA-seq) ، يتم تجاهل circRNAs عاده نتيجة لاختيار بولي-A اثناء بناء المكتبات mRNA ، أو وجدت في وفره منخفضه جدا ، التالي من الصعب عزل وكشف. هنا ، تم تحسين بروتوكول إنشاء مكتبه circRNA عن طريق مقارنه مجموعات اعداد المكتبة ، وخيارات ما قبل العلاج ومختلف الكميات الاجماليه لإدخال الحمض الريبي النيبالي. وقد تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة المتاحة تجاريا ، مع وبدون RNase R قبل المعالجة ، وباستخدام كميات متغيرة من إجمالي دخل الحمض الريبي النيبالي (1 إلى 4 ميكروغرام). وأخيرا ، أنواع متعددة من الانسجه ؛ بما في ذلك الكبد, الرئة, العقدة الليمفاوية, والبنكرياس; فضلا عن مناطق الدماغ متعددة; بما في ذلك المخيخ ، والفص الجداري السفلي ، والجيروسكوبات الصدغية الوسطي ، والقشرة القذالي ، والجيروسكوبات الاماميه المتفوقة. تمت مقارنتها لتقييم وفره circRNA عبر أنواع الانسجه. تحليل البيانات التي تم إنشاؤها الحمض الريبي-seq باستخدام سته مختلفه circRNA أدوات الكشف (find_circ ، CIRI ، Mapsplice ، سكين ، DCC ، و سيرسيكسبلورير) كشفت ان مجموعه من الجيش النيبالي السماوي اعداد مكتبه مجموعه عده مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام الحمض الريبي المدخلات هو الأمثل طريقه لتحديد العدد النسبي الأعلى من circRNAs. وتماشيا مع النتائج السابقة ، لوحظت اعلي نسبه إثراء في انسجه المخ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.

تم تقييم البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام السيطرة العالمية المتاحة تجاريا RNA (UC) واستخدام مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة ، وكلاهما يتضمن خطوه لاستنفاد الأوزون في بروتوكولاتهما. باستخدام سير عمل تحليلي (سير عمل تحليل البيانات ، القسم 4) ، بشكل عام ، تم الكشف عن عدد أكبر من circRNAs في مجموعا?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

التعميم RNAs (circRNAs) هي غير الترميز RNAs التي قد يكون لها ادوار في التنظيم عبر المعاقين والتوسط التفاعلات بين البروتينات. بعد تقييم المعلمات المختلفة لبناء مكتبات التسلسل circRNA ، تم تجميع بروتوكول باستخدام مجموع تقطعت بهم السبل الجيش النيبالي اعداد المكتبة مع RNase R ما قبل العلاج ويرد هنا.

تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

هذا البروتوكول هو نتيجة لتقييم الجوانب الرئيسية لإعداد مكتبة circrna، مثل نوع مجموعة، RNase R العلاج، كميات المدخلات وتأثيرها على الكشف عن سر الجيش الملكي النيبالي. وهو يتيح الكشف الأمثل عن الـCIRCRNA ويوفر بيانات عن المعلمات القابلة للتعديل حسب احتياجات المستخدم. إن تحديد الدوائر في أنواع عينات مختلفة سيساعدنا على فهم توزيع تعبيراتها بشكل أفضل ويمهد الطريق لتحديد الدور الوظيفي لهذه الجزيئات.يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي عينة RNA الإجمالي. من المهم الاحتفاظ بعينات الحمض النووي الريبي على الجليد قبل بدء البروتوكول. تقييم القيم RIN و DV200 على Bioanalyzer Agilent أو TapeStation قبل الإعدادية، واتبع الإجراءات المناسبة عند العمل مع RNA.تبدأ عن طريق تمييع الجيش الملكي النيبالي مجموع إلى أربعة ميكروغرام في 39 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase و pipetting ه صعودا وهبوطا لخلط. في أنبوب منفصل، استخدم 1x RNase R Buffer لتمييع RNase R إلى تركيز عمل يبلغ وحدتين لكل ميكرولتر. Pipette 39 ميكرولترات من مجموع الحمض النووي الريبي وخمسة ميكرولترات من 10x RNase R رد فعل العازلة في أنبوب رد فعل 1.5 ميكرولتر، ومزيج.إضافة ستة ميكرولترات من RNase المخفف R.Then ضبط ماصة لحجم التفاعل الكامل، وخلط الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، مع التأكد من أن حجم التفاعل الكامل مغمور في حمام الماء. ثم، ضع الأنبوب على الجليد، والمضي قدما على الفور مع تنظيف الجيش الملكي النيبالي والتركيز.قبل البدء، وإعداد العازلة غسل RNA عن طريق خلط التركيز مع 48 ملليلتر من الإيثانول 100٪، ووضع أعمدة تنقية في أنابيب جمع. عندما تكون جاهزة، إضافة اثنين من وحدات التخزين من RNA ملزمة المخزن المؤقت إلى RNase R-المعالجة العينة، ومزيج جيد. إضافة 150 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى الخليط لما مجموعه 300 ميكرولترات، ونقل وحدة التخزين بأكملها إلى العمود، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية.إزالة تدفق من خلال، وإضافة 400 ميكرولترات من RNA الإعدادية العازلة مباشرة إلى العمود. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية، والتخلص من خلال تدفق. ثم، إضافة 700 ميكرولترات من مخزن غسيل الحمض النووي الريبي إلى العمود، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية، وتجاهل تدفق من خلال.إضافة 400 ميكرولترات أخرى من الغسيل العازلة، والطرد المركزي لمدة دقيقتين، ونقل العمود إلى أنبوب جديد RNase خالية من 1.5 ملليلتر. إضافة بعناية 11 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase مباشرة إلى العمود عن طريق عقد تلميح ماصة الحق فوق مرشح العمود. دع العينة تجلس لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة.تأكد من تدفق من خلال في أنبوب 1.5 ملليلتر، وتجاهل العمود. يمكن تخزين عينة الحمض النووي الريبي المنقى في ناقص 80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لإعداد المكتبة. نقل 10 ميكرولترات من RNA مجموع تنقية إلى بئر نظيفة في لوحة PCR 96-well.إضافة خمسة microliters من RRNA ملزمة العازلة تليها خمسة microliters من مزيج إزالة RRNA، ثم ماص بلطف صعودا وهبوطا لخلط الكواشف. ختم لوحة، واحتضانه لمدة خمس دقائق في 68 درجة مئوية على كتلة ثيرموسيسير مسبق البرمجة ومحمّاة مسبقا. بعد الحضانة، والسماح لوحة الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.إزالة الختم من لوحة، وإضافة 35 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة دوامة rRNA الخرز إزالة إلى العينة. ضبط ماصة إلى 45 ميكروليترس، وماصات صعودا وهبوطا 10 إلى 20 مرات لخلط دقيق. دع اللوحة تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.نقل لوحة إلى موقف مغناطيسي، واحتضان هناك لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتم مسح الحل. نقل فائقة إلى بئر جديدة على لوحة. ثم نقل لوحة من موقف المغناطيسي إلى لوحة حامل.دوامة RNA تنظيف الخرز حتى يتم تفريقها بشكل جيد، وإضافة 99 ميكرولترات من الخرز إلى العينة. الماصات صعودا وهبوطا لخلط، واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. نقل لوحة إلى موقف المغناطيسي، وتركها هناك لمدة خمس دقائق أو حتى الحل مسح، ثم إزالة وتجاهل جميع supernatant من البئر.مع لوحة لا تزال على موقف المغناطيسي، إضافة 200 ميكرولترات من الطازجة أعد 80٪ الإيثانول إلى البئر دون تعطيل الخرز. اترك الإيثانول في البئر لمدة 30 ثانية، ثم قم بإزالته والتخلص منه. إضافة 11 ميكروليتر من عازلة Elution إلى البئر، وماصة لأعلى ونضزال لخلط.احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين، ثم نقله مرة أخرى إلى موقف المغناطيسي، والاحتفاظ بها هناك حتى يتم مسح الحل. نقل 8.5 ميكرولترات من السوبر إلى بئر جديدة على نفس اللوحة، وإضافة 8.5 ميكرولترات من إلوت، التمهيدي، جزء عالية ميكس إلى كل بئر تحتوي على عينة. الماصات صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط جيدا، وختم لوحة، واحتضانه لمدة ثماني دقائق في الحرارية محمّاة مسبقا إلى 94 درجة مئوية.تبريد العينة إلى أربع درجات مئوية، وإزالة لوحة من الدراجات الحرارية، والطرد المركزي لفترة وجيزة. وتم تقييم طقمتين لإعداد المكتبات، هما تروسك وكابا، لهذا البروتوكول. وعموما، تم الكشف عن عدد أكبر من RNAs التعميم وانخفاض نسبة من الحمض النووي الريبي الريبوسي عند استخدام مجموعة TruSeq، لذلك تم اختيار TruSeq لإجراء مزيد من التجارب.تم تقييم أهمية المعالجة المسبقة RNase R بمقارنة البيانات المتولدة من المكتبات المعالجة المسبقة وغير المعالجة مسبقة. وكما هو متوقع، تم تحديد عدد أكبر من الرنا قدامى التعميم في المكتبات المعالجة المسبقة مقارنة بالمكتبات غير المعالجة. تم تحسين كمية الإدخال RNA للكشف عن تنوع أعلى من الحمض النووي الريبي الدائري.تم إعداد المكتبات باستخدام واحد واثنين وأربع ميكروغرام من المدخلات RNA، ولوحظ أعلى تنوع من أنواع الحمض النووي الريبي الدائري عند استخدام أربعة ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. وقد استخدم البروتوكول الأمثل لمقارنة وفرة الجيش الملكي النيبالي الدائري في خمس مناطق في الدماغ من أربعة متبرعين أصحاء والأنواع الأخرى من الأنسجة من ستة متبرعين أصحاء. عموما، لوحظ وجود وفرة أعلى من RNase دائرية في الدماغ مقارنة مع أنواع الأنسجة الأخرى.من المهم أن نتذكر أن تتبع الإجراءات المناسبة عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي، بما في ذلك ارتداء القفازات، وتنظيف جيدا مقاعد البدلاء والماصات مع مناديل RNase أو رذاذ قبل البدء في البروتوكول، والحفاظ على RNA على الجليد مسبقا. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء التحقق من صحة متعامد مثل تسلسل Sanger من تقاطعات محيطة عرنيا محددة. اكتشاف الدوائر الجديدة والمزيد من الأدلة على وجودها يقتطع مجالا جديدا من البحوث لاستكشاف وظائفها البيولوجية.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

وسم الأيضية والتنميط لنقل الكشف باستخدام ماكروارايس

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Overexpressing الكشف فضله منذ فترة طويلة باستخدام الجينات-تفعيل كريسبر

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2&#039;-O-Methyl RNAs

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...