Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Vi er taknemmelige for banneret Sun Health Research Institute Brain og Body donation program (BBDP) af Sun City, Arizona for levering af menneskelige hjernevæv. BBDP er blevet støttet af det nationale Institut for neurologiske lidelser og slagtilfælde (U24 NS072026 national hjerne-og vævs ressource for Parkinsons sygdom og beslægtede lidelser), National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimers sygdom Core Center), Arizona Department of Health Services (kontrakt 211002, Arizona Alzheimers Research Center), Arizona biomedicinsk forskning provision (kontrakter 4001, 0011, 05-901 og 1001 til Arizona Parkinsons sygdom konsortium) og Michael Jørgensen. Fox Foundation for Parkinsons forskning27. Denne undersøgelse blev også støttet af DHS og staten Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). Vi takker også Andrea Schmitt (banner Research) og Cynthia Lechuga (TGen) for administrativ støtte.

Denne forskning er blevet udført i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskers velfærd. Hjernevæv blev opnået fra banneret Sun Health Research Institute Brain og Body donation program i Sun City, AZ. Operationerne i hjernen og organ donation program er godkendt af den vestlige institutionelle Review Board (WIRB Protocol #20120821). Alle eller deres juridiske repræsentanter underskrev det informerede samtykke. Kommercielle (ikke-hjerne) bioprøver blev købt ho...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).</li><li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

I denne undersøgelse blev to kommercielt tilgængelige Biblioteks forberedelses kits, præ-behandlingsmuligheder og input-RNA-beløb testet for at optimere en circRNA-berigelses protokol til opførelse af circRNA sekvensering biblioteker. På baggrund af undersøgelsens vurderinger er en række vigtige aspekter og kritiske trin i skabelsen af circRNA-sekvensering af biblioteker tydeligt. Vores evaluering bekræfter nytten af RNase R forbehandling, som afspejlet i det øgede antal circRNAs detekteret. Samlet set blev der...

Cirkulære RNAs (circrnas) er endogene, ikke-kodning RNAs, der har fået opmærksomhed i betragtning af deres omsiggribende udtryk i eukaryote transkriptomet1,2,3. De er dannet, når exons back-Splice til hinanden og dermed oprindeligt blev anset for at være splejsning artefakter4,5. Men, nylige undersøgelser har vist, at circrnas udviser celletype, væv, og udviklingsmæssige fase specifikke udtryk3,6 og er evolutionært bevaret2,3. Desuden er de involveret i mægling af protein-protein interaktioner7, mikro-RNA (Mirna) bindende3,8,9,10, og regulering af forældrenes gen transkriptionen11.
I klassisk RNA-sekvensering (RNA-SEQ), kan circRNAs være helt tabt under biblioteks konstruktionen som et resultat af poly-et valg for mRNAs eller kan være vanskeligt at isolere i betragtning af deres lave overflod. Men, nylige circrna karakterisering undersøgelser har indarbejdet en præ-behandling trin ved hjælp af RNase Rasmussen for at berige for circrnas2,12,13. RNase Rasmussen er en exoribonuclease, der fordøjer lineære RNAs, efterlader cirkulære RNA strukturer. CircRNA-berigelses protokoller blev optimeret ved at generere og sammenligne data fra to kommercielt tilgængelige hele transkriptome Library byggesæt, med og uden et RNase R forbehandlings trin, og ved hjælp af varierende mængder af samlet RNA-input (1 til 4 μg). Den optimerede protokol blev derefter brugt til at evaluere den overflod af circRNAs på tværs af fem forskellige hjerneområder (cerebellum [BC], ringere parietal lap [IP], Middle Temporal gyrus [MG], occipital cortex [OC] og overlegne frontal gyrus [SF]) og fire andre vævstyper (leveren [LV], lunge [LU], lymfeknude [LN] og bugspytkirtel [PA]). RNA-SEQ-bibliotekerne blev parret sekvenserede, og data blev analyseret ved hjælp af seks forskellige circRNA-forudsigelses algoritmer: find_circ3, Ciri14, mapsplice15, Knife16, DCC17og circexplorer18. Baseret på vores analyse, det højeste antal af unikke circRNAs blev detekteret, når du bruger en strandede samlede RNA bibliotek forberedelse kit med RNase R forbehandling og 4 μg samlede input RNA. Den optimerede protokol er beskrevet her. Som tidligere rapporteret19,20, den højeste berigelse af circrnas blev observeret i hjernen sammenlignet med andre vævstyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Cirkulære RNAs (circRNAs) er en klasse af ikke-kodning RNAs involveret i funktioner, herunder mikro-RNA (miRNA) regulering, mægling af protein-protein interaktioner, og regulering af forældrenes gen transkriptionen. I klassisk næste generation af RNA-sekvensering (RNA-SEQ), er circRNAs typisk overset som et resultat af poly-A udvælgelse under opførelsen af mRNA biblioteker, eller findes på meget lav overflod, og er derfor vanskeligt at isolere og opdage. Her blev en circRNA Library Construction Protocol optimeret ved at sammenligne Biblioteks forberedelses kits, forbehandlings muligheder og forskellige samlede RNA-input beløb. To kommercielt tilgængelige hele transcriptome Library Preparation kits, med og uden RNase R forbehandling, og ved hjælp af variable mængder af samlede RNA-input (1 til 4 μg), blev testet. Endelig, flere vævstyper; herunder lever, lunge, lymfeknude, og bugspytkirtel; samt flere hjerneområder; herunder cerebellum, ringere parietal lap, Middle Temporal gyrus, occipital cortex, og overlegne frontal gyrus; blev sammenlignet med at evaluere circRNA overflod på tværs af vævstyper. Analyse af de genererede RNA-SEQ-data ved hjælp af seks forskellige circRNA-detektionsværktøjer (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC og CIRCexplorer) afslørede, at et strandede total RNA-Biblioteks forberedelses kit med RNase R-forbehandling og 4 μg RNA-input er den optimale metode til identifikation af det højeste relative antal circRNAs. I overensstemmelse med tidligere fund blev den højeste berigelse af circRNAs observeret i hjernevæv sammenlignet med andre vævstyper.

Data genereret ved hjælp af en kommercielt tilgængelig Universal Control RNA (UC) og ved hjælp af to bibliotek forberedelse kits, som begge omfatter en Ribo-udtynding trin i deres protokoller, blev først vurderet. Ved hjælp af en analytisk arbejdsproces (workflow for data analyse, afsnit 4) blev der samlet set fundet et højere antal circRNAs i data sætternes TruSeq-datasæt sammenlignet med kapa-dem (figur 1). Selv om ribosomale RNA (rRNA)-procenterne var under 5% i datasæt fra begge...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Cirkulære RNAs (circRNAs) er ikke-kodning RNAs, der kan have roller i transkriptional regulering og medierende interaktioner mellem proteiner. Efter vurdering af forskellige parametre for opførelse af circRNA sekvensering biblioteker, en protokol blev udarbejdet ved hjælp af strandede samlede RNA bibliotek forberedelse med RNase R præ-behandling og præsenteres her.

Identifikation af cirkulære RNAs ved hjælp af RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Denne protokol er resultatet af at evaluere centrale aspekter af circRNA bibliotek forberedelse, såsom kit type, RNase R behandling, input mængder og deres indvirkning på circRNA afsløring. Det muliggør optimal circRNA-detektion og giver data om justerbare parametre afhængigt af brugerens behov. Identifikation circRNAs i forskellige prøvetyper vil hjælpe os til bedre at forstå fordelingen af deres udtryk og sætter scenen for delineating den funktionelle rolle af disse molekyler.Denne metode kan anvendes på enhver total RNA-prøve. Det er vigtigt at opbevare RNA-prøver på is, før protokollen påbegyndes. Vurder RIN- og DV200-værdierne på Agilent Bioanalyzer eller TapeStation før forberedelsen, og følg de relevante procedurer, når du arbejder med RNA.Begynd med at fortynde det samlede RNA til fire mikrogram i 39 mikroliter RNase-frit vand og pipettere det op og ned for at blande. I et separat rør anvendes 1x RNase R Buffer til at fortynde RNase R til en arbejdskoncentration på to enheder pr. mikroliter. Pipette 39 mikroliter af det samlede RNA og fem mikroliter af 10x RNase R reaktionsbuffer i et 1,5 mikroliters reaktionsrør og blandes.Der tilsættes seks mikroliter af den fortyndede RNase R.Juster derefter pipetten til fuld reaktionsvolumen, og bland opløsningen ved at pipettere op og ned 10 gange. Placer røret i et 37-graders Celsius-vandbad i 10 minutter, og sørg for, at den fulde reaktionsvolumen er nedsænket i vandbadet. Derefter placere røret på is, og straks gå videre med RNA oprydning og koncentration.Før du starter, forberedes RNA-vaskebufferen ved at blande koncentratet med 48 milliliter 100% ethanol, og rensningssøjlerne anbringes i opsamlingsrør. Når du er klar, skal du tilføje to bind RNA-bindingsbuffer til den RNase R-behandlede prøve og blandes godt. Der tilsættes 150 mikroliter på 100% ethanol til blandingen for i alt 300 mikroliter, overfør hele volumen til kolonnen og centrifuge i 30 sekunder.Fjern flowet igennem, og tilføj 400 mikroliter RNA Prep Buffer direkte til kolonnen. Centrifuge i 30 sekunder, og kassér strømmen igennem. Derefter tilsættes 700 mikroliter RNA-vaskebuffer til kolonnen, centrifuge i 30 sekunder, og kassér strømmen igennem.Tilsæt yderligere 400 mikroliter af vaskebufferen, centrifuge i to minutter, og overfør kolonnen til et frisk RNase-frit 1,5 milliliterrør. Tilsæt forsigtigt 11 mikroliter RNase-frit vand direkte til kolonnen ved at holde pipettespidsen lige over kolonnefilteret. Lad prøven sidde i et minut ved stuetemperatur, og derefter centrifuge det i et minut.Sørg for, at der er flow igennem i 1,5-milliliter røret, og kassér kolonnen. Den rensede RNA-prøve kan opbevares ved minus 80 grader Celsius eller anvendes straks til biblioteksforberedelse. Overfør 10 mikroliter af det rensede totale RNA til en ren brønd i en 96-brønd PCR-plade.Der tilsættes fem mikroliter rRNA-bindingsbuffer efterfulgt af fem mikroliter rRNA-fjernelsesblanding, hvortil pipetters forsigtigt op og ned for at blande reagenserne. Forsegle pladen, og inkubere den i fem minutter ved 68 grader Celsius på en forprogrammeret og forvarmet termocykator blok. Efter inkubationen skal pladen sidde ved stuetemperatur i et minut.Fjern forseglingen fra pladen, og tilsæt 35 mikroliter af vortexed rumtemperatur rRNA fjernelse perler til prøven. Juster pipetten til 45 mikroliter, og pipette op og ned 10 til 20 gange for grundigt at blande. Lad pladen sidde ved stuetemperatur i et minut.Overfør pladen til et magnetisk stativ, og inkuber den der i et minut, eller indtil opløsningen er klar. Overfør supernatanten til ny brønd på pladen. Overfør derefter pladen fra den magnetiske stativ til pladestanderen.Vortex RNA oprydning perler, indtil de er godt spredt, og tilsæt 99 mikroliter af perler til prøven. Pipette op og ned for at blande, og inkubere pladen ved stuetemperatur i 10 minutter. Overfør pladen til den magnetiske stativ, og lad den stå der i fem minutter, eller indtil opløsningen ryddes, fjern og kassér derefter al supernatant fra brønden.Med pladen stadig på den magnetiske stativ, tilsættes 200 mikroliter frisklavet 80% ethanol til brønden uden at forstyrre perlerne. Lad ethanolen være i brønden i 30 sekunder, og fjern den og kassér den derefter. Tilføj 11 mikroliter af Elution Buffer til brønden, og pipette det op og ned for at blande.Inkuber pladen ved stuetemperatur i to minutter, og overfør den derefter tilbage til den magnetiske stativ, og hold den der, indtil opløsningen er klar. Overfør 8,5 mikroliter af supernatanten til en ny brønd på samme plade, og tilsæt 8,5 mikroliter af Elute, Primer, Fragment High Mix til hver brønd, der indeholder en prøve. Pipette op og ned 10 gange for at blande grundigt, forsegle pladen, og inkubere den i otte minutter i en thermocycler forvarmet til 94 grader Celsius.Prøven afkøles til fire grader Celsius, pladen fjernes fra termocyren, og den centrifugeres kortvarigt. To biblioteksforberedelsessæt, TruSeq og KAPA, blev vurderet for denne protokol. Samlet set blev der fundet et højere antal cirkulære RNA'er og lavere procentdel af ribosomal RNA ved brug af TruSeq-sættet, så TruSeq blev udvalgt til yderligere eksperimenter.Betydningen af RNase R-forbehandling blev evalueret ved at sammenligne data fra forbehandlede og ikke-forbehandlede biblioteker. Som forventet blev et større antal cirkulære RNA'er konsekvent identificeret i de forbehandlede biblioteker sammenlignet med ikke-forbehandlede biblioteker. Mængden af input RNA blev optimeret til at opdage en højere mangfoldighed af cirkulære RNA'er.Biblioteker blev udarbejdet ved hjælp af et, to og fire mikrogram input RNA, og den højeste mangfoldighed af cirkulære RNA-arter blev observeret ved brug af fire mikrogram total RNA. Den optimerede protokol blev brugt til at sammenligne cirkulære RNA-forekomster i fem hjerneregioner fra fire raske donorer og for andre vævstyper fra seks raske donorer. Samlet set blev der observeret en højere forekomst af cirkulær RNase i hjernen sammenlignet med andre vævstyper.Det er vigtigt at huske at følge passende procedurer, når du arbejder med RNA, herunder iført handsker, grundig rengøring af bænken og pipetter med RNase klude eller spray før du begynder protokollen, og holde RNA på is på forhånd. Efter denne procedure kan der udføres ortogonal validering såsom Sanger-sekvensering af identificerede circRNA-vejkryds. Opdagelsen af nye circRNAs og yderligere beviser for deres tilstedeværelse udskærer et nyt forskningsområde for at udforske deres biologiske funktioner.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transkriptom Analyse af<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA sekventering data via Tuxedo Suite på Galaxy-projektet

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifikke og selektiv anerkendelse af dobbelt-strenget RNA'er over enkeltstrenget RNA'er af kemisk modificerede peptid nukleinsyrer

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliske mærkning og profilering af overførsel RNA'er ved hjælp af Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjælden begivenhed registrering ved hjælp af fejl-korrigeret DNA og RNA sekventering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overekspression længe Noncoding RNA'er ved hjælp af gen-aktivering CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering af mRNA fra fuldblod ved hjælp af Nanopmalm sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...