Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

We zijn dankbaar voor de banner Sun Health Research Institute Brain and Body donatieprogramma (BBDP) van Sun City, Arizona voor de verstrekking van menselijke hersenweefsels. De BBDP is gesteund door het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte (U24 NS072026 nationale hersenen en weefsel resource voor de ziekte van Parkinson en verwante aandoeningen), het Nationaal Instituut voor veroudering (P30AG19610 Arizona Alzheimer Disease core Center), de Arizona Department of Health Services (contract 211002, Arizona Alzheimer Research Center), de Arizona Biomedical Research Commission (contracten 4001, 0011, 05-901 en 1001 aan het Arizona Parkinson disease Consortium) en de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson27. Deze studie werd ook gesteund door de DHS en de staat Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). We bedanken ook Andrea Schmitt (banner Research) en Cynthia lechuga (TGen) voor administratieve ondersteuning.

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het welzijn van de mens. Hersenen weefsels werden verkregen uit de banner Sun Health Research Institute hersenen en lichaam donatieprogramma in Sun City, AZ. De operaties van het brein-en lichaams donatieprogramma zijn goedgekeurd door de Western Institutional Review Board (WIRB protocol #20120821). Alle onderwerpen of hun wettelijke vertegenwoordigers ondertekenden de geïnformeerde toestemming. Commerci?...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).</li><li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

In deze studie werden twee in de handel verkrijgbare bibliotheek voorbereidings kits, voorbehandelings opties en input RNA-bedragen getest om een circRNA-verrijkings protocol voor de bouw van circRNA-sequencing-bibliotheken te optimaliseren. Op basis van de beoordelingen van deze studie, zijn een aantal belangrijke aspecten en kritieke stappen bij het maken van circRNA-sequencing bibliotheken duidelijk. Onze evaluatie bevestigt het nut van RNase R voor behandeling, zoals weergegeven door het toegenomen aantal Circrna's g...

Circulaire rna's (circrna's) zijn endogene, niet-Codeer rna's die aandacht hebben gekregen gezien hun pervasieve expressie in de eukaryote transcriptome1,2,3. Ze worden gevormd wanneer exonen terug-Splice aan elkaar en dus werden aanvankelijk beschouwd als splicing artefacten4,5. Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat circrnas celtype, weefsel en ontwikkelingsfase specifieke expressie3,6 vertoont en evolutionair wordt bewaard op2,3. Bovendien zijn ze betrokken bij de bemiddeling van eiwit-eiwit interacties7, micro-RNA (Mirna) binding3,8,9,10, en regulering van ouderlijke genen transcriptie11.
In de klassieke RNA-sequencing (RNA-SEQ), kan circRNAs volledig verloren gaan tijdens de bibliotheek constructie als gevolg van poly-een selectie voor Mrna's of kan het moeilijk zijn om te isoleren gezien hun geringe overvloed. Recente circrna-karakterisering studies hebben echter een voorbehandelings stap opgenomen met behulp van RNase R om te verrijken voor circrnas2,12,13. RNase R is een exoribonuclease die lineaire Rna's verteerd, waardoor circulaire RNA-structuren achterblijven. CircRNA verrijking protocollen werden geoptimaliseerd door het genereren en vergelijken van gegevens van twee commercieel beschikbare hele transcriptome bibliotheek bouwkits, met en zonder een RNase R voor behandeling stap, en het gebruik van verschillende hoeveelheden totaal RNA input (1 tot 4 μg). Het geoptimaliseerde protocol werd vervolgens gebruikt om de overvloed aan Circrna's te evalueren in vijf verschillende hersengebieden (cerebellum [BC], inferieure Pariëtale kwab [IP], middelste temporele gyrus [MG], occipitale cortex [OC] en superieure frontale gyrus [SF]) en vier andere weefsel typen (lever [LV], Long [LU], lymfeklier [LN] en alvleesklier [PA]). RNA-SEQ-bibliotheken werden gekoppeld aan de eind geordend en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van zes verschillende circrna Voorspellings algoritmen: find_circ3, ciri14, mapsplice15, Knife16, DCC17en circexplorer18. Op basis van onze analyse werd het hoogste aantal unieke Circrna's gedetecteerd bij het gebruik van een gestrande totale RNA Library Preparation Kit met RNase R voor behandeling en 4 μg totaal input RNA. Het geoptimaliseerde protocol wordt hier beschreven. Zoals eerder gemeld19,20, de hoogste verrijking van circrnas werd waargenomen in de hersenen in vergelijking met andere weefsel soorten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Circulaire Rna's (Circrna's) zijn een klasse van niet-Codeer Rna's die betrokken zijn bij functies zoals micro-RNA (miRNA)-regulering, bemiddeling van eiwit-eiwit interacties en regulering van de transcriptie van ouder genen. In de klassieke volgende generatie RNA sequencing (RNA-SEQ), Circrna's worden meestal over het hoofd gezien als gevolg van poly-een selectie tijdens de bouw van mRNA Bibliotheken, of zijn te vinden op zeer lage overvloed, en zijn daarom moeilijk te isoleren en op te sporen. Hier werd een circRNA Library Construction protocol geoptimaliseerd door het vergelijken van bibliotheek voorbereidings kits, pre-behandelingsopties en verschillende totaal RNA input bedragen. Twee in de handel verkrijgbare complete transcriptome bibliotheek voorbereidings kits, met en zonder RNase R voor behandeling, en het gebruik van variabele hoeveelheden RNA input (1 tot 4 μg), werden getest. Ten slotte, meerdere weefsel typen; waaronder lever, longen, lymfeklieren en pancreas; naast meerdere hersengebieden; met inbegrip van de cerebellum, inferieure Pariëtale kwab, middelste temporele gyrus, occipitale cortex, en superieure frontale gyrus; werden vergeleken om de overvloed van circRNA over weefsel typen te evalueren. Analyse van de gegenereerde RNA-SEQ-gegevens met behulp van zes verschillende circRNA-detectietools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC en CIRCexplorer) onthulde dat een gestrande Total RNA Library-Voorbereidingspakket met RNase R voor behandeling en 4 μg RNA-input de optimale methode voor het identificeren van het hoogste relatieve aantal Circrna's. In overeenstemming met eerdere bevindingen werd de hoogste verrijking van circRNAs waargenomen in hersenweefsels in vergelijking met andere weefsel typen.

Gegevens die zijn gegenereerd met behulp van een in de handel verkrijgbare universele controle RNA (UC) en met behulp van twee bibliotheek voorbereidings kits, die beide een ribo-depletie-stap in hun protocollen bevatten, werden eerst beoordeeld. Met behulp van een analytische workflow (Data Analysis workflow, sectie 4), over het algemeen, werd een hoger aantal Circrna's gedetecteerd in de TruSeq datasets in vergelijking met de Kapa Ones (Figuur 1). Hoewel de ribosomale RNA (rRNA) percentage...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circulaire Rna's (Circrna's) zijn niet-Codeer Rna's die mogelijk rollen hebben in transcriptionele regulatie en die interacties tussen eiwitten bemiddel- Na beoordeling van verschillende parameters voor de bouw van circRNA sequencing Bibliotheken, een protocol werd gecompileerd met behulp van gestrande Total RNA Library voorbereiding met RNase R pre-behandeling en wordt hier gepresenteerd.

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Dit protocol is het resultaat van de evaluatie van de belangrijkste aspecten van circRNA-bibliotheekvoorbereiding, zoals het type kit, RNase R-behandeling, invoerbedragen en hun impact op circRNA-detectie. Het maakt een optimale circRNA-detectie mogelijk en levert gegevens over aanpasbare parameters, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker. Het identificeren van circRNAs in verschillende monstertypen zal ons helpen om de verdeling van hun expressie beter te begrijpen en stelt de weg in voor het afbakenen van de functionele rol van deze moleculen.Deze methode kan worden toegepast op elk totaal RNA-monster. Het is belangrijk om RNA-monsters op ijs te houden voordat het protocol wordt begin. Beoordeel de RIN- en DV200-waarden op de Agilent Bioanalyzer of TapeStation vóór de voorbereiding en volg de juiste procedures bij het werken met RNA.Begin met het verdunnen van het totale RNA tot vier microgram in 39 microliter RNase-vrij water en pipetten het op en neer te mengen. Gebruik in een aparte buis 1x RNase R Buffer om de RNase R te verdunnen tot een werkconcentratie van twee eenheden per microliter. Pipette 39 microliters van totale RNA en vijf microliters van 10x RNase R Reaction Buffer in een 1,5-microliter reactiebuis, en meng.Voeg zes microliter van de verdunde RNase R.Vervolgens de pipet aan te passen aan het volledige reactievolume en meng de oplossing door 10 keer op en neer te pipetten. Plaats de buis in een 37-graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten, zorg ervoor dat het volledige reactievolume wordt ondergedompeld in het waterbad. Plaats vervolgens de buis op ijs en ga onmiddellijk verder met RNA-opruimen en concentratie.Bereid de RNA Wash Buffer voor voordat u begint met het mengen van het concentraat met 48 milliliter ethanol van 100% en plaats zuiveringskolommen in opvangbuizen. Voeg twee delen RNA Binding Buffer toe aan het RNase R-behandelde monster en meng goed. Voeg 150 microliter van 100% ethanol toe aan het mengsel voor een totaal van 300 microliter, breng het volledige volume over naar de kolom en vercentrifuge gedurende 30 seconden.Verwijder de stroom door, en voeg 400 microliter van RNA Prep Buffer rechtstreeks aan de kolom. Centrifuge gedurende 30 seconden, en gooi de stroom door. Voeg vervolgens 700 microliter RNA Wash Buffer toe aan de kolom, centrifuge gedurende 30 seconden en gooi de stroom door.Voeg nog eens 400 microliter van de Wasbuffer toe, centrifuge gedurende twee minuten en breng de kolom over naar een verse RNase-vrije buis van 1,5 milliliter. Voeg voorzichtig 11 microliter RNase-vrij water direct aan de kolom door de pipetpunt recht boven het kolomfilter te houden. Laat het monster een minuut op kamertemperatuur zitten en centrifuger het vervolgens gedurende één minuut.Zorg ervoor dat er stroom door in de 1,5-milliliter buis, en gooi de kolom. Het gezuiverde RNA-monster kan worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius of onmiddellijk worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek. Breng 10 microliter van het gezuiverde totale RNA over naar een schone put in een 96-well PCR-plaat.Voeg vijf microliters rRNA Binding Buffer toe, gevolgd door vijf microliters rRNA Removal Mix, enpipet vervolgens zachtjes op en neer om de reagentia te mengen. Verzegel de plaat en broed het vijf minuten uit bij 68 graden Celsius op een voorgeprogrammeerd en voorverwarmd thermocyclerblok. Laat de plaat na de incubatie een minuut op kamertemperatuur zitten.Verwijder de afdichting van de plaat en voeg 35 microliter vortexed kamertemperatuur rRNA verwijdering kralen aan het monster. Pas de pipet aan op 45 microliters en pipet 10 tot 20 keer op en neer om grondig te mengen. Laat de plaat een minuut op kamertemperatuur zitten.Breng de plaat naar een magnetische standaard en broed deze daar een minuut of totdat de oplossing is gewist. Breng de supernatant naar nieuwe goed op de plaat. Breng vervolgens de plaat van de magnetische standaard over naar de plaatstandaard.Vortex RNA opruimen kralen totdat ze goed zijn verspreid, en voeg 99 microliter kralen aan het monster. Pipette op en neer om te mengen, en de plaat in tecuniseren bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng de plaat naar de magnetische standaard, en laat het daar voor vijf minuten of totdat de oplossing wist, verwijder en gooi alle supernatant uit de put.Met de plaat nog steeds op de magnetische standaard, voeg 200 microliters van vers bereide 80% ethanol aan de put zonder verstoring van de kralen. Laat de ethanol in de put gedurende 30 seconden, verwijder en gooi het. Voeg 11 microliter elution buffer aan de put, en pipette het op en neer te mengen.Broed de plaat twee minuten op kamertemperatuur, breng deze vervolgens terug naar de magnetische standaard en bewaar hem daar totdat de oplossing is opgelost. Breng 8,5 microliter van de supernatant naar een nieuwe put op dezelfde plaat, en voeg 8,5 microliter van Elute, Primer, Fragment High Mix aan elke put met een monster. Pipet op en neer 10 keer om grondig te mengen, verzegelen de plaat, en uitbroeden gedurende acht minuten in een thermocycler voorverwarmd tot 94 graden Celsius.Koel het monster tot vier graden Celsius, verwijder de plaat uit de thermocycler en centrifuge het kort. Twee bibliotheekvoorbereidingskits, TruSeq en KAPA, werden voor dit protocol beoordeeld. Over het algemeen werd een hoger aantal cirkel-RNAs en een lager percentage ribosomale RNA gedetecteerd bij het gebruik van de TruSeq-kit, dus TruSeq werd geselecteerd voor verdere experimenten.De betekenis van RNase R-voorbehandeling werd geëvalueerd door de gegevens te vergelijken die zijn gegenereerd uit voorbehandelde en niet-voorbehandelde bibliotheken. Zoals verwacht werd in de voorbehandelde bibliotheken consequent een groter aantal circulaire RNA's geïdentificeerd in vergelijking met niet-voorbehandelde bibliotheken. De hoeveelheid input RNA werd geoptimaliseerd voor het detecteren van een hogere diversiteit aan circulaire RNAs.Bibliotheken werden bereid met behulp van een, twee en vier microgram van input RNA, en de hoogste diversiteit van circulaire RNA soorten werd waargenomen bij het gebruik van vier microgram van het totale RNA. Het geoptimaliseerde protocol werd gebruikt om circulaire RNA overvloeden te vergelijken in vijf hersengebieden van vier gezonde donoren en voor andere weefselsoorten van zes gezonde donoren. Over het algemeen werd een hogere overvloed aan circulaire RNase waargenomen in de hersenen in vergelijking met andere weefseltypen.Het is belangrijk om te onthouden om de juiste procedures te volgen bij het werken met RNA, met inbegrip van het dragen van handschoenen, het grondig reinigen van de bank en pipetten met RNase doekjes of spray voordat u het protocol, en het houden van RNA op ijs vooraf. Na deze procedure kan orthogonale validatie worden uitgevoerd, zoals Sanger sequencing van geïdentificeerde circRNA-knooppunten. De ontdekking van nieuwe circRNAs en verder bewijs van hun aanwezigheid kerft een nieuw onderzoeksgebied voor het verkennen van hun biologische functies.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptoom analyse<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabole Labeling en profilering van overdracht RNAs met behulp van Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing lang Noncoding RNAs met behulp van gen-activeren CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...