Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
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Nous sommes reconnaissants au Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) de Sun City, arizona pour la fourniture de tissus cérébraux humains. Le BBDP a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), le National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), l'Arizona Department of Health Services (contrat 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), l'Arizona Biomedical Research Commission (contrats 4001, 0011, 05-901 et 1001 au Arizona Parkinson's Disease Consortium) et le Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research27. Cette étude a également été soutenue par le DHS et l'État de l'Arizona (subvention adhS14-052688). Nous remercions également Andrea Schmitt (Banner Research) et Cynthia Lechuga (TGen) pour leur soutien administratif.

Cette recherche a été effectuée conformément à toutes les lignes directrices institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain. Des tissus cérébraux ont été obtenus à partir du programme de don de cerveau et de corps du Banner Sun Health Research Institute à Sun City, AZ. Les activités du Programme de dons de cerveauets et de corps sont approuvées par la Western Institutional Review Board (wirB protocol #20120821). Tous les sujets ou leurs représentants légaux ont signé le ...

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	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

Dans le cadre de cette étude, deux trousses de préparation de bibliothèques disponibles dans le commerce, des options de prétraitement et des quantités d'ARN d'entrée ont été testées afin d'optimiser un protocole d'enrichissement de l'ARNrc pour la construction de bibliothèques de séquençage circRNA. D'après les évaluations de cette étude, un certain nombre d'aspects clés et d'étapes critiques dans la création de bibliothèques de séquençage circRNA sont apparents. Notre évaluation confirme l'utilit?...

Les ARN circulaires (CircRNAs) sont des ARN endogènes et non codants qui ont retenu l'attention compte tenu de leur expression omniprésente dans la transcriptome eucaryotique1,2,3. Ils sont formés lorsque les exons dos-épissage à l'autre et ont donc été initialement considérés comme des artefacts épissage4,5. Cependant, des études récentes ont démontré que les circRNAs présentent le type de cellule, le tissu, et l'expression spécifique de stade développemental3,6 et sont évolutivement conservés2,3. En outre, ils sont impliqués dans la médiation des interactions protéine-protéine7, micro-ARN (miRNA) liant3,8,9,10, et la régulation de la transcription des gènes parentaux11.
Dans le séquençage classique d'ARN (ARN-seq), les circRNAs peuvent être complètement perdus pendant la construction de bibliothèque en raison de la sélection de poly-A pour des ARNM ou peuvent être difficiles à isoler étant donné leur faible abondance. Cependant, des études récentes de caractérisation circRNA ont incorporé une étape de pré-traitement en utilisant RNase R afin d'enrichir pour les circRNAs2,12,13. RNase R est une exoribonucane qui digère les ARN linéaires, laissant derrière elle des structures circulaires d'ARN. Les protocoles d'enrichissement de CircRNA ont été optimisés en générant et en comparant les données de deux kits de construction de bibliothèques de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans étape de prétraitement R R, et en utilisant des quantités variables d'entrée totale d'ARN (1 à 4 g). Le protocole optimisé a ensuite été utilisé pour évaluer l'abondance des circARN dans cinq régions différentes du cerveau (cerebellum [BC], lobe pariétal inférieur [IP], gyrus temporel moyen [MG], cortex occipital [OC] et gyrus frontal supérieur [SF]) et quatre autres types de tissus (foie [LV], poumon [LU], ganglion [LN] et pancréas[PA]). Les bibliothèques RNA-seq ont été appariées fin séquencée et les données ont été analysées à l'aide de six algorithmes de prédiction circRNA différents: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, et CIRCexplorer18. Sur la base de notre analyse, le plus grand nombre de circRNAs uniques a été détecté lors de l'utilisation d'une trousse de préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et 4 arn d'entrée total. Le protocole optimisé est décrit ici. Comme précédemment rapporté19,20, l'enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans le cerveau par rapport à d'autres types de tissus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Les ARN circulaires (circRNAs) sont une classe d'ARN non codants impliqués dans des fonctions telles que la régulation des micro-ARN (miRNA), la médiation des interactions protéines-protéines et la régulation de la transcription des gènes parentaux. Dans le séquençage classique de l'ARN de prochaine génération (ARN-seq), les circARN sont généralement négligés en raison de la sélection poly-A lors de la construction des bibliothèques d'ARNm, ou se trouvent à très faible abondance, et sont donc difficiles à isoler et à détecter. Ici, un protocole de construction de la bibliothèque circRNA a été optimisé en comparant les trousses de préparation de la bibliothèque, les options de prétraitement et diverses quantités totales d'entrée d'ARN. Deux trousses de préparation de la bibliothèque de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans prétraitement R, et utilisant des quantités variables d'entrée totale d'ARN (1 à 4 g), ont été testées. Enfin, plusieurs types de tissus; y compris le foie, les poumons, les ganglions lymphatiques et le pancréas; ainsi que de multiples régions du cerveau; y compris le cervelet, le lobe pariétal inférieur, le gyrus temporel moyen, le cortex occipital, et le gyrus frontal supérieur ; ont été comparés pour évaluer l'abondance de circRNA à travers des types de tissu. L'analyse des données ARN-seq générées à l'aide de six différents outils de détection de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC et CIRCexplorer) a révélé qu'une trousse de préparation totale de la bibliothèque d'ARN échouée avec le prétraitement R r et l'entrée d'ARN de 4 g est l'entrée optimale de l'ARN pour identifier le plus grand nombre relatif de circRNAs. Conformément aux résultats précédents, l'enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans les tissus de cerveau comparés à d'autres types de tissu.

Les données générées à l'aide d'un ARN de contrôle universel (UC) disponible dans le commerce et à l'aide de deux trousses de préparation de la bibliothèque, qui comprennent toutes deux une étape d'épuisement des ribo dans leurs protocoles, ont d'abord été évaluées. À l'aide d'un flux de travail analytique (flux de travail d'analyse de données, section 4), dans l'ensemble, un plus grand nombre de circRNAs a été détecté dans les ensembles de données TruSeq par rapport à ceux de Kapa (<strong class="...

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Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN non codants qui peuvent avoir des rôles dans la régulation transcriptionnelle et la médiation des interactions entre les protéines. Après l'évaluation de différents paramètres pour la construction des bibliothèques de séquençage circRNA, un protocole a été compilé utilisant la préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et est présenté ici.

Identification des ARN circulaires à l'aide du séquençage de l'ARN

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Ce protocole est le résultat de l’évaluation des aspects clés de la préparation de la bibliothèque circRNA, tels que le type de kit, le traitement RNase R, les quantités d’entrée et leur impact sur la détection de l’ARN circ. Il permet une détection optimale du circARN et fournit des données sur les paramètres réglables en fonction des besoins de l’utilisateur. L’identification des circARN dans différents types d’échantillons nous aidera à mieux comprendre la distribution de leur expression et ouvre la voie à la délimitation du rôle fonctionnel de ces molécules.Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel échantillon total d’ARN. Il est important de conserver les échantillons d’ARN sur la glace avant de commencer le protocole. Évaluez les valeurs RIN et DV200 sur le Bioanalyzer Agilent ou le TapeStation avant la préparation, et suivez les procédures appropriées lorsque vous travaillez avec l’ARN.Commencez par diluer l’ARN total à quatre microgrammes dans 39 microlitres d’eau sans RNase et pipetting de haut en bas pour mélanger. Dans un tube séparé, utilisez 1x RNase R Buffer pour diluer le RNase R à une concentration de travail de deux unités par microlitre. Pipette 39 microlitres de l’ARN total et cinq microlitres de 10x RNase R Reaction Buffer dans un tube de réaction de 1,5 microlitre, et mélanger.Ajouter six microlitres de la RNase R.Then diluée ajuster la pipette au volume de réaction complet, et mélanger la solution en pipetting de haut en bas 10 fois. Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, en vous assurant que le volume de réaction complet est immergé dans le bain d’eau. Ensuite, placez le tube sur la glace et procédez immédiatement au nettoyage et à la concentration de l’ARN.Avant de commencer, préparez le tampon de lavage d’ARN en mélangeant le concentré avec 48 millilitres de 100% éthanol, et placez des colonnes de purification dans des tubes de collecte. Une fois prêt, ajouter deux volumes de tampon de liaison ARN à l’échantillon RNase R traité, et bien mélanger. Ajouter 150 microlitres de 100% d’éthanol au mélange pour un total de 300 microlitres, transférer tout le volume à la colonne, et centrifugeuse pendant 30 secondes.Retirez le flux à travers, et ajouter 400 microlitres de tampon de préparation d’ARN directement à la colonne. Centrifugeuse pendant 30 secondes, et jeter le flux à travers. Ensuite, ajoutez 700 microlitres de tampon de lavage d’ARN à la colonne, centrifugeuse pendant 30 secondes, et jetez le flux à travers.Ajouter 400 microlitres supplémentaires du tampon de lavage, centrifugeuse pendant deux minutes, et transférer la colonne dans un tube frais sans RNase de 1,5 millilitre. Ajouter délicatement 11 microlitres d’eau sans RNase directement à la colonne en tenant la pointe pipette juste au-dessus du filtre de colonne. Laissez reposer l’échantillon pendant une minute à température ambiante, puis centrifugez-le pendant une minute.Assurez-vous qu’il y a un écoulement dans le tube de 1,5 millilitre et jetez la colonne. L’échantillon d’ARN purifié peut être conservé à moins 80 degrés Celsius ou utilisé immédiatement pour la préparation de la bibliothèque. Transférer 10 microlitres de l’ARN total purifié dans un puits propre dans une plaque PCR de 96 puits.Ajouter cinq microlitres de rRNA Binding Buffer suivi de cinq microlitres de rRNA Removal Mix, puis pipette doucement de haut en bas pour mélanger les reagents. Sceller la plaque et l’incuber pendant cinq minutes à 68 degrés Celsius sur un bloc thermocycleur préprogrammé et préchauffé. Après l’incubation, laisser reposer la plaque à température ambiante pendant une minute.Retirer le joint de la plaque et ajouter 35 microlitres de perles d’enlèvement de rRNA à température ambiante vortexées à l’échantillon. Réglez la pipette à 45 microlitres, et pipette de haut en bas 10 à 20 fois pour bien mélanger. Laissez reposer l’assiette à température ambiante pendant une minute.Transférez la plaque sur un support magnétique et incubez-la pendant une minute ou jusqu’à ce que la solution se dégage. Transférer le surnatant dans un nouveau puits dans l’assiette. Ensuite, transférez la plaque du support magnétique au support de la plaque.Vortex ARN nettoyer les perles jusqu’à ce qu’ils soient bien dispersés, et ajouter 99 microlitres de perles à l’échantillon. Pipette de haut en bas pour mélanger, et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes. Transférez la plaque sur le support magnétique et laissez-la là pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que la solution se dégage, puis retirez et jetez tout supernatant du puits.Avec la plaque encore sur le support magnétique, ajouter 200 microlitres de 80% d’éthanol fraîchement préparé au puits sans perturber les perles. Laissez l’éthanol dans le puits pendant 30 secondes, puis retirez-le et jetez-le. Ajouter 11 microlitres d’Elution Buffer au puits, et pipette de haut en bas pour mélanger.Incuber la plaque à température ambiante pendant deux minutes, puis la transférer sur le support magnétique, et la garder là jusqu’à ce que la solution se dégage. Transférer 8,5 microlitres du supernatant dans un nouveau puits sur la même plaque et ajouter 8,5 microlitres d’Elute, Primer, Fragment High Mix à chaque puits contenant un échantillon. Pipette de haut en bas 10 fois pour bien mélanger, sceller la plaque, et l’incuber pendant huit minutes dans un thermocycleur préchauffé à 94 degrés Celsius.Refroidissez l’échantillon à quatre degrés Celsius, retirez la plaque du thermocycleur et centrifugez-la brièvement. Deux trousses de préparation à la bibliothèque, TruSeq et KAPA, ont été évaluées pour ce protocole. Dans l’ensemble, un plus grand nombre d’ARN circulaires et un pourcentage plus faible d’ARN ribosomal ont été détectés lors de l’utilisation du kit TruSeq, de sorte que TruSeq a été sélectionné pour d’autres expériences.L’importance du prétraitement RNase R a été évaluée en comparant les données générées par les bibliothèques prétraitées et non prétraitées. Comme prévu, un plus grand nombre d’ARN circulaires ont été systématiquement identifiés dans les bibliothèques prétraitées par rapport aux bibliothèques non prétraitées. La quantité d’ARN d’entrée a été optimisée pour détecter une plus grande diversité d’ARN circulaires.Les bibliothèques ont été préparées à l’aide d’un, deux et quatre microgrammes d’ARN d’entrée, et la plus grande diversité d’espèces circulaires d’ARN a été observée lors de l’utilisation de quatre microgrammes d’ARN total. Le protocole optimisé a été utilisé pour comparer les abondances circulaires d’ARN dans cinq régions du cerveau de quatre donneurs en bonne santé et pour d’autres types de tissus de six donneurs en bonne santé. Dans l’ensemble, une plus grande abondance de RNase circulaire a été observée dans le cerveau par rapport à d’autres types de tissus.Il est important de se rappeler de suivre les procédures appropriées lorsque vous travaillez avec l’ARN, y compris le port de gants, le nettoyage complet du banc et des pipettes avec des lingettes RNase ou spray avant de commencer le protocole, et de garder l’ARN sur la glace à l’avance. Après cette procédure, la validation orthogonale telle que le séquençage sanger des jonctions identifiées de circARN peut être exécutée. La découverte de nouveaux circARN et d’autres preuves de leur présence forment un nouveau domaine de recherche pour explorer leurs fonctions biologiques.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Recherche

Génétique

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Cartographie des interactions ARN-ARN à l&#39;échelle mondiale à l&#39;aide de psoralène biotinylé

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

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Analyse transcriptomique de<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA séquençage des données par le Tuxedo Suite sur le projet Galaxy

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