Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
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Nous sommes reconnaissants au Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) de Sun City, arizona pour la fourniture de tissus cérébraux humains. Le BBDP a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), le National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), l'Arizona Department of Health Services (contrat 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), l'Arizona Biomedical Research Commission (contrats 4001, 0011, 05-901 et 1001 au Arizona Parkinson's Disease Consortium) et le Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research27. Cette étude a également été soutenue par le DHS et l'État de l'Arizona (subvention adhS14-052688). Nous remercions également Andrea Schmitt (Banner Research) et Cynthia Lechuga (TGen) pour leur soutien administratif.

Cette recherche a été effectuée conformément à toutes les lignes directrices institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain. Des tissus cérébraux ont été obtenus à partir du programme de don de cerveau et de corps du Banner Sun Health Research Institute à Sun City, AZ. Les activités du Programme de dons de cerveauets et de corps sont approuvées par la Western Institutional Review Board (wirB protocol #20120821). Tous les sujets ou leurs représentants légaux ont signé le ...

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	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

Dans le cadre de cette étude, deux trousses de préparation de bibliothèques disponibles dans le commerce, des options de prétraitement et des quantités d'ARN d'entrée ont été testées afin d'optimiser un protocole d'enrichissement de l'ARNrc pour la construction de bibliothèques de séquençage circRNA. D'après les évaluations de cette étude, un certain nombre d'aspects clés et d'étapes critiques dans la création de bibliothèques de séquençage circRNA sont apparents. Notre évaluation confirme l'utilit?...

Les ARN circulaires (CircRNAs) sont des ARN endogènes et non codants qui ont retenu l'attention compte tenu de leur expression omniprésente dans la transcriptome eucaryotique1,2,3. Ils sont formés lorsque les exons dos-épissage à l'autre et ont donc été initialement considérés comme des artefacts épissage4,5. Cependant, des études récentes ont démontré que les circRNAs présentent le type de cellule, le tissu, et l'expression spécifique de stade développemental3,6 et sont évolutivement conservés2,3. En outre, ils sont impliqués dans la médiation des interactions protéine-protéine7, micro-ARN (miRNA) liant3,8,9,10, et la régulation de la transcription des gènes parentaux11.
Dans le séquençage classique d'ARN (ARN-seq), les circRNAs peuvent être complètement perdus pendant la construction de bibliothèque en raison de la sélection de poly-A pour des ARNM ou peuvent être difficiles à isoler étant donné leur faible abondance. Cependant, des études récentes de caractérisation circRNA ont incorporé une étape de pré-traitement en utilisant RNase R afin d'enrichir pour les circRNAs2,12,13. RNase R est une exoribonucane qui digère les ARN linéaires, laissant derrière elle des structures circulaires d'ARN. Les protocoles d'enrichissement de CircRNA ont été optimisés en générant et en comparant les données de deux kits de construction de bibliothèques de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans étape de prétraitement R R, et en utilisant des quantités variables d'entrée totale d'ARN (1 à 4 g). Le protocole optimisé a ensuite été utilisé pour évaluer l'abondance des circARN dans cinq régions différentes du cerveau (cerebellum [BC], lobe pariétal inférieur [IP], gyrus temporel moyen [MG], cortex occipital [OC] et gyrus frontal supérieur [SF]) et quatre autres types de tissus (foie [LV], poumon [LU], ganglion [LN] et pancréas[PA]). Les bibliothèques RNA-seq ont été appariées fin séquencée et les données ont été analysées à l'aide de six algorithmes de prédiction circRNA différents: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, et CIRCexplorer18. Sur la base de notre analyse, le plus grand nombre de circRNAs uniques a été détecté lors de l'utilisation d'une trousse de préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et 4 arn d'entrée total. Le protocole optimisé est décrit ici. Comme précédemment rapporté19,20, l'enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans le cerveau par rapport à d'autres types de tissus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Les ARN circulaires (circRNAs) sont une classe d'ARN non codants impliqués dans des fonctions telles que la régulation des micro-ARN (miRNA), la médiation des interactions protéines-protéines et la régulation de la transcription des gènes parentaux. Dans le séquençage classique de l'ARN de prochaine génération (ARN-seq), les circARN sont généralement négligés en raison de la sélection poly-A lors de la construction des bibliothèques d'ARNm, ou se trouvent à très faible abondance, et sont donc difficiles à isoler et à détecter. Ici, un protocole de construction de la bibliothèque circRNA a été optimisé en comparant les trousses de préparation de la bibliothèque, les options de prétraitement et diverses quantités totales d'entrée d'ARN. Deux trousses de préparation de la bibliothèque de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans prétraitement R, et utilisant des quantités variables d'entrée totale d'ARN (1 à 4 g), ont été testées. Enfin, plusieurs types de tissus; y compris le foie, les poumons, les ganglions lymphatiques et le pancréas; ainsi que de multiples régions du cerveau; y compris le cervelet, le lobe pariétal inférieur, le gyrus temporel moyen, le cortex occipital, et le gyrus frontal supérieur ; ont été comparés pour évaluer l'abondance de circRNA à travers des types de tissu. L'analyse des données ARN-seq générées à l'aide de six différents outils de détection de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC et CIRCexplorer) a révélé qu'une trousse de préparation totale de la bibliothèque d'ARN échouée avec le prétraitement R r et l'entrée d'ARN de 4 g est l'entrée optimale de l'ARN pour identifier le plus grand nombre relatif de circRNAs. Conformément aux résultats précédents, l'enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans les tissus de cerveau comparés à d'autres types de tissu.

Les données générées à l'aide d'un ARN de contrôle universel (UC) disponible dans le commerce et à l'aide de deux trousses de préparation de la bibliothèque, qui comprennent toutes deux une étape d'épuisement des ribo dans leurs protocoles, ont d'abord été évaluées. À l'aide d'un flux de travail analytique (flux de travail d'analyse de données, section 4), dans l'ensemble, un plus grand nombre de circRNAs a été détecté dans les ensembles de données TruSeq par rapport à ceux de Kapa (<strong class="...

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Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN non codants qui peuvent avoir des rôles dans la régulation transcriptionnelle et la médiation des interactions entre les protéines. Après l'évaluation de différents paramètres pour la construction des bibliothèques de séquençage circRNA, un protocole a été compilé utilisant la préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et est présenté ici.

Identification des ARN circulaires à l'aide du séquençage de l'ARN

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Ce protocole est le résultat de l’évaluation des aspects clés de la préparation de la bibliothèque circRNA, tels que le type de kit, le traitement RNase R, les quantités d’entrée et leur impact sur la détection de l’ARN circ. Il permet une détection optimale du circARN et fournit des données sur les paramètres réglables en fonction des besoins de l’utilisateur. L’identification des circARN dans différents types d’échantillons nous aidera à mieux comprendre la distribution de leur expression et ouvre la voie à la délimitation du rôle fonctionnel de ces molécules.Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel échantillon total d’ARN. Il est important de conserver les échantillons d’ARN sur la glace avant de commencer le protocole. Évaluez les valeurs RIN et DV200 sur le Bioanalyzer Agilent ou le TapeStation avant la préparation, et suivez les procédures appropriées lorsque vous travaillez avec l’ARN.Commencez par diluer l’ARN total à quatre microgrammes dans 39 microlitres d’eau sans RNase et pipetting de haut en bas pour mélanger. Dans un tube séparé, utilisez 1x RNase R Buffer pour diluer le RNase R à une concentration de travail de deux unités par microlitre. Pipette 39 microlitres de l’ARN total et cinq microlitres de 10x RNase R Reaction Buffer dans un tube de réaction de 1,5 microlitre, et mélanger.Ajouter six microlitres de la RNase R.Then diluée ajuster la pipette au volume de réaction complet, et mélanger la solution en pipetting de haut en bas 10 fois. Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, en vous assurant que le volume de réaction complet est immergé dans le bain d’eau. Ensuite, placez le tube sur la glace et procédez immédiatement au nettoyage et à la concentration de l’ARN.Avant de commencer, préparez le tampon de lavage d’ARN en mélangeant le concentré avec 48 millilitres de 100% éthanol, et placez des colonnes de purification dans des tubes de collecte. Une fois prêt, ajouter deux volumes de tampon de liaison ARN à l’échantillon RNase R traité, et bien mélanger. Ajouter 150 microlitres de 100% d’éthanol au mélange pour un total de 300 microlitres, transférer tout le volume à la colonne, et centrifugeuse pendant 30 secondes.Retirez le flux à travers, et ajouter 400 microlitres de tampon de préparation d’ARN directement à la colonne. Centrifugeuse pendant 30 secondes, et jeter le flux à travers. Ensuite, ajoutez 700 microlitres de tampon de lavage d’ARN à la colonne, centrifugeuse pendant 30 secondes, et jetez le flux à travers.Ajouter 400 microlitres supplémentaires du tampon de lavage, centrifugeuse pendant deux minutes, et transférer la colonne dans un tube frais sans RNase de 1,5 millilitre. Ajouter délicatement 11 microlitres d’eau sans RNase directement à la colonne en tenant la pointe pipette juste au-dessus du filtre de colonne. Laissez reposer l’échantillon pendant une minute à température ambiante, puis centrifugez-le pendant une minute.Assurez-vous qu’il y a un écoulement dans le tube de 1,5 millilitre et jetez la colonne. L’échantillon d’ARN purifié peut être conservé à moins 80 degrés Celsius ou utilisé immédiatement pour la préparation de la bibliothèque. Transférer 10 microlitres de l’ARN total purifié dans un puits propre dans une plaque PCR de 96 puits.Ajouter cinq microlitres de rRNA Binding Buffer suivi de cinq microlitres de rRNA Removal Mix, puis pipette doucement de haut en bas pour mélanger les reagents. Sceller la plaque et l’incuber pendant cinq minutes à 68 degrés Celsius sur un bloc thermocycleur préprogrammé et préchauffé. Après l’incubation, laisser reposer la plaque à température ambiante pendant une minute.Retirer le joint de la plaque et ajouter 35 microlitres de perles d’enlèvement de rRNA à température ambiante vortexées à l’échantillon. Réglez la pipette à 45 microlitres, et pipette de haut en bas 10 à 20 fois pour bien mélanger. Laissez reposer l’assiette à température ambiante pendant une minute.Transférez la plaque sur un support magnétique et incubez-la pendant une minute ou jusqu’à ce que la solution se dégage. Transférer le surnatant dans un nouveau puits dans l’assiette. Ensuite, transférez la plaque du support magnétique au support de la plaque.Vortex ARN nettoyer les perles jusqu’à ce qu’ils soient bien dispersés, et ajouter 99 microlitres de perles à l’échantillon. Pipette de haut en bas pour mélanger, et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes. Transférez la plaque sur le support magnétique et laissez-la là pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que la solution se dégage, puis retirez et jetez tout supernatant du puits.Avec la plaque encore sur le support magnétique, ajouter 200 microlitres de 80% d’éthanol fraîchement préparé au puits sans perturber les perles. Laissez l’éthanol dans le puits pendant 30 secondes, puis retirez-le et jetez-le. Ajouter 11 microlitres d’Elution Buffer au puits, et pipette de haut en bas pour mélanger.Incuber la plaque à température ambiante pendant deux minutes, puis la transférer sur le support magnétique, et la garder là jusqu’à ce que la solution se dégage. Transférer 8,5 microlitres du supernatant dans un nouveau puits sur la même plaque et ajouter 8,5 microlitres d’Elute, Primer, Fragment High Mix à chaque puits contenant un échantillon. Pipette de haut en bas 10 fois pour bien mélanger, sceller la plaque, et l’incuber pendant huit minutes dans un thermocycleur préchauffé à 94 degrés Celsius.Refroidissez l’échantillon à quatre degrés Celsius, retirez la plaque du thermocycleur et centrifugez-la brièvement. Deux trousses de préparation à la bibliothèque, TruSeq et KAPA, ont été évaluées pour ce protocole. Dans l’ensemble, un plus grand nombre d’ARN circulaires et un pourcentage plus faible d’ARN ribosomal ont été détectés lors de l’utilisation du kit TruSeq, de sorte que TruSeq a été sélectionné pour d’autres expériences.L’importance du prétraitement RNase R a été évaluée en comparant les données générées par les bibliothèques prétraitées et non prétraitées. Comme prévu, un plus grand nombre d’ARN circulaires ont été systématiquement identifiés dans les bibliothèques prétraitées par rapport aux bibliothèques non prétraitées. La quantité d’ARN d’entrée a été optimisée pour détecter une plus grande diversité d’ARN circulaires.Les bibliothèques ont été préparées à l’aide d’un, deux et quatre microgrammes d’ARN d’entrée, et la plus grande diversité d’espèces circulaires d’ARN a été observée lors de l’utilisation de quatre microgrammes d’ARN total. Le protocole optimisé a été utilisé pour comparer les abondances circulaires d’ARN dans cinq régions du cerveau de quatre donneurs en bonne santé et pour d’autres types de tissus de six donneurs en bonne santé. Dans l’ensemble, une plus grande abondance de RNase circulaire a été observée dans le cerveau par rapport à d’autres types de tissus.Il est important de se rappeler de suivre les procédures appropriées lorsque vous travaillez avec l’ARN, y compris le port de gants, le nettoyage complet du banc et des pipettes avec des lingettes RNase ou spray avant de commencer le protocole, et de garder l’ARN sur la glace à l’avance. Après cette procédure, la validation orthogonale telle que le séquençage sanger des jonctions identifiées de circARN peut être exécutée. La découverte de nouveaux circARN et d’autres preuves de leur présence forment un nouveau domaine de recherche pour explorer leurs fonctions biologiques.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Cartographie des interactions ARN-ARN à l&#39;échelle mondiale à l&#39;aide de psoralène biotinylé

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Recherche

Génétique

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

Marquage métabolique et profilage des ARN de transfert à l’aide de macroréseaux

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Surexprimant ARN Long non codantes en utilisant activation génique CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Séquençage de l’ARNm de sang total à l’aide du séquençage NANOPORE

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

Identification des empreintes de pas de l'ARN: Complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'ARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2&#039;-O-Methyl RNAs

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...