Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
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Wir danken dem Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) in Sun City, Arizona, für die Bereitstellung von menschlichem Hirngewebe. Das BBDP wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson es Disease and Related Disorders), dem National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer es Disease Core Center), dem Arizona Department of Health Services (Vertrag 211002, Arizona Alzheimer es Research Center), die Arizona Biomedical Research Commission (Verträge 4001, 0011, 05-901 und 1001 an das Arizona Parkinson es Disease Consortium) und das Michael J. Fox Foundation for Parkinson es Research27. Diese Studie wurde auch vom DHS und dem Bundesstaat Arizona unterstützt (ADHS-Stipendium ADHS14-052688). Wir danken auch Andrea Schmitt (Banner Research) und Cynthia Lechuga (TGen) für die administrative Unterstützung.

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Leitlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Hirngewebe wurde vom Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program in Sun City, AZ, bezogen. Die Operationen des Brain and Body Donation Program werden vom Western Institutional Review Board (WIRB-Protokoll #20120821) genehmigt. Alle Probanden oder ihre gesetzlichen Vertreter unterzeichneten die informierte Einwilligung. Kommerzielle (nicht...

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	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

In dieser Studie wurden zwei kommerziell erhältliche Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und Eingangs-RNA-Mengen getestet, um ein circRNA-Anreicherungsprotokoll für den Bau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken zu optimieren. Basierend auf den Bewertungen dieser Studie sind eine Reihe wichtiger Aspekte und kritische Schritte bei der Erstellung von circRNA-Sequenzierungsbibliotheken offensichtlich. Unsere Bewertung bestätigt den Nutzen der RNase R-Vorbehandlung, was sich in der erhöhten Anzahl der na...

Circular RNAs (CircRNAs) sind endogene, nicht-kodierende RNAs, die aufgrund ihrer allgegenwärtigen Expression im eukaryotischen Transkriptom1,2,3Aufmerksamkeit erlangt haben. Sie werden gebildet, wenn exons zurück zueinander und daher wurden zunächst als spleißende Artefakte4,5. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass CircRNAs Zelltyp, Gewebe und Entwicklungsstadium spezifische Expression3,6 aufweisen und evolutionär konserviert sind2,3. Darüber hinaus sind sie an der Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen7, Mikro-RNA (miRNA) Bindung3,8,9,10, und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt11.
Bei der klassischen RNA-Sequenzierung (RNA-seq) können CircRNAs während des Bibliotheksbaus als Folge der Poly-A-Auswahl für mRNAs vollständig verloren gehen oder aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwer zu isolieren sein. Jüngste CircRNA-Charakterisierungsstudien haben jedoch einen Vorbehandlungsschritt mit RNase R integriert, um für circRNAs2,12,13anzureichern. RNase R ist eine Exoribonuklease, die lineare RNAs verdaut und kreisförmige RNA-Strukturen hinterlässt. CircRNA-Anreicherungsprotokolle wurden optimiert, indem Daten aus zwei kommerziell erhältlichen Gesamt-Transkriptom-Bibliotheksbausätzen mit und ohne RNase R-Vorbehandlungsschritt generiert und verglichen wurden und unterschiedliche Mengen an RNA-Eingang (1 bis 4 g) verwendet wurden. Das optimierte Protokoll wurde als nächstes verwendet, um die Häufigkeit von CircRNAs in fünf verschiedenen Hirnregionen (Kleinhirn [BC], minderwertiger parietaler Lappen [IP], mittlerer zeitlicher Gyrus [MG], okzipitaler Kortex [OC] und überlegener frontaler Gyrus [SF]) und vier anderen Gewebetypen (Leber [LV], Lunge [LU], Lymphknoten [LN] und Bauchspeicheldrüse [PA]) zu bewerten. RNA-Seq-Bibliotheken wurden am Ende sequenziert und die Daten wurden mit sechs verschiedenen circRNA-Vorhersagealgorithmen analysiert: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17und CIRCexplorer18. Basierend auf unserer Analyse wurde die höchste Anzahl einzigartiger CircRNAs bei der Verwendung eines gestrandeten gesamten RNA-Bibliotheksvorbereitungskits mit RNase R-Vorbehandlung und 4 g Gesamt-Input-RNA nachgewiesen. Das optimierte Protokoll wird hier beschrieben. Wie bereits berichtet19,20, wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Circular RNAs (circRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs, die an Funktionen wie Mikro-RNA-Regulierung (miRNA), Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt sind. In der klassischen RNA-Sequenzierung der nächsten Generation (RNA-seq) werden CircRNAs in der Regel als Ergebnis der Poly-A-Auswahl während des Aufbaus von mRNA-Bibliotheken übersehen oder sind in sehr geringer Häufigkeit zu finden und daher schwer zu isolieren und zu erkennen. Hier wurde ein circRNA-Bibliotheksbauprotokoll optimiert, indem Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und verschiedene gesamte RNA-Eingangsmengen verglichen wurden. Getestet wurden zwei handelsübliche Volltranskriptom-Bibliotheksvorbereitungskits mit und ohne RNase R-Vorbehandlung und unter Verwendung variabler Mengen des gesamten RNA-Eingangs (1 bis 4 g). Schließlich, mehrere Gewebetypen; einschließlich Leber, Lunge, Lymphknoten und Bauchspeicheldrüse; sowie mehrere Hirnregionen; einschließlich des Kleinhirns, des minderwertigen parietalen Lappens, des mittleren zeitlichen Gyrus, des okzipitalen Kortex und des überlegenen frontalen Gyrus; wurden verglichen, um die Häufigkeit von ZirkRNA über Gewebetypen hinweg zu bewerten. Die Analyse der generierten RNA-Seq-Daten mit sechs verschiedenen circRNA-Detektionswerkzeugen (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC und CIRCexplorer) ergab, dass ein gestrandetes Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitungskit mit RNase R-Vorbehandlung und 4-g-RNA-Eingang der optimale Methode zur Identifizierung der höchsten relativen Anzahl von circRNAs. Im Einklang mit früheren Befunden wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs in Hirngeweben im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.

Die daten, die mit einer kommerziell erhältlichen Universal Control RNA (UC) und mit zwei Bibliotheksvorbereitungskits generiert wurden, die beide einen Ribo-Erschöpfungsschritt in ihren Protokollen enthalten, wurden zuerst ausgewertet. Mit Hilfe eines analytischen Workflows (Datenanalyse-Workflow, Abschnitt 4) wurde insgesamt eine höhere Anzahl von circRNAs in den TruSeq-Datasets im Vergleich zu den Kapa-Datasets erkannt (Abbildung 1). Obwohl die ribosomalen RNA-Prozentsätze (rRNA) in D...

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Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Dieses Protokoll ist das Ergebnis der Bewertung wichtiger Aspekte der CircRNA-Bibliotheksvorbereitung, wie Kit-Typ, RNase-R-Behandlung, Eingangsmengen und deren Auswirkungen auf die circRNA-Erkennung. Es ermöglicht eine optimale circRNA-Erkennung und liefert Daten zu einstellbaren Parametern, die von den Bedürfnissen des Benutzers abhängen. Die Identifizierung von CircRNAs in verschiedenen Probentypen wird uns helfen, die Verteilung ihrer Expression besser zu verstehen und die Voraussetzungen für die Abgrenzung der funktionellen Rolle dieser Moleküle zu stellen.Diese Methode kann auf jede gesamte RNA-Probe angewendet werden. Es ist wichtig, RNA-Proben vor Beginn des Protokolls auf Eis zu halten. Bewerten Sie die RIN- und DV200-Werte auf dem Agilent Bioanalyzer oder TapeStation vor der Vorbereitung, und befolgen Sie die entsprechenden Verfahren bei der Arbeit mit RNA.Beginnen Sie mit der Verdünnung der gesamten RNA auf vier Mikrogramm in 39 Mikroliter RNase-freiem Wasser und pipetieren Sie es nach oben und unten, um es zu mischen. Verwenden Sie in einem separaten Rohr den 1x RNase R Buffer, um die RNase R auf eine Arbeitskonzentration von zwei Einheiten pro Mikroliter zu verdünnen. Pipette 39 Mikroliter gesamter RNA und fünf Mikroliter 10x RNase R Reaktionspuffer in ein 1,5-Mikroliter-Reaktionsrohr und mischen.Fügen Sie sechs Mikroliter der verdünnten RNase R.Dann stellen Sie die Pipette auf volles Reaktionsvolumen, und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren nach oben und unten 10 mal. Legen Sie das Rohr 10 Minuten lang in ein 37-Grad-Wasserbad, um sicherzustellen, dass das volle Reaktionsvolumen in das Wasserbad eingetaucht ist. Dann legen Sie die Röhre auf Eis, und gehen Sie sofort mit RNA-Reinigung und Konzentration.Vor dem Start den RNA-Waschpuffer vorbereiten, indem Sie das Konzentrat mit 48 Millilitern 100% Ethanol mischen und Reinigungssäulen in Sammelrohre legen. Wenn Sie bereit sind, fügen Sie der RNase R-behandelten Probe zwei Bände RNA-Bindungspuffer hinzu und mischen Sie sie gut. 150 Mikroliter 100% Ethanol in das Gemisch für insgesamt 300 Mikroliter geben, das gesamte Volumen auf die Säule übertragen und 30 Sekunden zentrifugieren.Entfernen Sie den Durchfluss, und fügen Sie 400 Mikroliter RNA Prep Buffer direkt zur Spalte hinzu. Zentrifuge für 30 Sekunden, und entsorgen Sie den Fluss durch. Fügen Sie dann 700 Mikroliter RNA-Waschpuffer in die Spalte, Zentrifuge für 30 Sekunden, und entsorgen Sie den Durchfluss durch.Fügen Sie weitere 400 Mikroliter des Waschpuffers, Zentrifuge für zwei Minuten, und übertragen Sie die Säule auf eine frische RNase-freie 1,5-Milliliter-Rohr. Fügen Sie vorsichtig 11 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt in die Säule ein, indem Sie die Pipettenspitze direkt über dem Säulenfilter halten. Lassen Sie die Probe eine Minute bei Raumtemperatur sitzen, und zentrifugieren Sie sie dann für eine Minute.Stellen Sie sicher, dass in der 1,5-Milliliter-Röhre durchgeflossen ist, und entsorgen Sie die Spalte. Die gereinigte RNA-Probe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert oder sofort zur Bibliotheksvorbereitung verwendet werden. Übertragen Sie 10 Mikroliter der gereinigten Gesamt-RNA in einen sauberen Brunnen in einer 96-Well-PCR-Platte.Fügen Sie fünf Mikroliter rRNA Binding Buffer gefolgt von fünf Mikroliterr rRNA Removal Mix hinzu, dann sanft Pipetten nach oben und unten, um die Reagenzien zu mischen. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie sie fünf Minuten lang bei 68 Grad Celsius auf einem vorprogrammierten und vorgeheizten Thermocyclerblock. Nach der Inkubation die Platte eine Minute bei Raumtemperatur sitzen lassen.Entfernen Sie die Dichtung von der Platte, und fügen Sie 35 Mikroliter wirbelnden Raumtemperatur rRNA Entfernungsperlen in die Probe. Stellen Sie die Pipette auf 45 Mikroliter und die Pipette 10 bis 20 Mal nach oben und unten ein, um sie gründlich zu mischen. Lassen Sie die Platte eine Minute bei Raumtemperatur sitzen.Übertragen Sie die Platte auf einen magnetischen Ständer, und inkubieren Sie sie dort für eine Minute oder bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Brunnen auf dem Teller. Dann übertragen Sie die Platte vom magnetischen Ständer auf den Plattenständer.Vortex RNA Cleanup Perlen, bis sie gut dispergiert sind, und fügen Sie 99 Mikroliter Perlen in die Probe. Pipette nach oben und unten zu mischen, und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Übertragen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer, und lassen Sie es dort für fünf Minuten oder bis die Lösung klar, dann entfernen und entsorgen Sie alle Überstand aus dem Brunnen.Mit der Platte noch auf dem magnetischen Ständer, fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitet80%Ethanol in den Brunnen, ohne die Perlen zu stören. Lassen Sie das Ethanol 30 Sekunden im Brunnen, entfernen sie und entsorgen Sie es. Fügen Sie 11 Mikroliter Elution Buffer in den Brunnen, und Pipette es nach oben und unten zu mischen.Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Minuten, dann übertragen Sie sie zurück auf den magnetischen Stand, und halten Sie sie dort, bis die Lösung klar ist. 8,5 Mikroliter des Überstandes auf einen neuen Brunnen auf derselben Platte übertragen und 8,5 Mikroliter Elute, Primer, Fragment High Mix zu jedem Brunnen hinzufügen, der eine Probe enthält. Pipette 10 Mal nach oben und unten, um gründlich zu mischen, versiegeln Sie die Platte, und inkubieren Sie es für acht Minuten in einem Thermocycler vorgewärmt auf 94 Grad Celsius.Kühlen Sie die Probe auf vier Grad Celsius, entfernen Sie die Platte aus dem Thermocycler und zentrifugieren Sie sie kurz. Zwei Bibliotheksvorbereitungskits, TruSeq und KAPA, wurden für dieses Protokoll bewertet. Insgesamt wurde bei der Verwendung des TruSeq-Kits eine höhere Anzahl von kreisförmigen RNAs und ein geringerer Prozentsatz ribosomaler RNA nachgewiesen, so dass TruSeq für weitere Experimente ausgewählt wurde.Die Signifikanz der RNase R-Vorbehandlung wurde durch den Vergleich der Daten aus vorbehandelten und nicht vorbehandelten Bibliotheken bewertet. Wie erwartet wurde in den vorbehandelten Bibliotheken eine höhere Anzahl von kreisförmigen RNAs im Vergleich zu nicht vorbehandelten Bibliotheken einheitlich identifiziert. Die Menge der Eingangs-RNA wurde optimiert, um eine höhere Vielfalt an kreisförmigen RNAs zu erkennen.Bibliotheken wurden mit einem, zwei und vier Mikrogramm Input-RNA erstellt, und die höchste Vielfalt an kreisförmigen RNA-Arten wurde beobachtet, wenn vier Mikrogramm gesamter RNA verwendet wurden. Das optimierte Protokoll wurde verwendet, um kreisförmige RNA-Überfluss in fünf Hirnregionen von vier gesunden Spendern und für andere Gewebetypen von sechs gesunden Spendern zu vergleichen. Insgesamt wurde eine höhere Fülle von kreisförmiger RNase im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, bei der Arbeit mit RNA geeignete Verfahren zu befolgen, einschließlich des Tragens von Handschuhen, gründlicher Reinigung der Bank und Pipetten mit RNase-Tüchern oder Spray, bevor Sie das Protokoll beginnen, und die RNA vorher auf Eis zu halten. Nach diesem Verfahren kann eine orthogonale Validierung wie die Sanger-Sequenzierung identifizierter CircRNA-Knoten durchgeführt werden. Die Entdeckung neuer CircRNAs und weitere Beweise für ihre Anwesenheit erschließen ein neues Forschungsgebiet für die Erforschung ihrer biologischen Funktionen.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Forschung

Genetik

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Überexprimierenden lange forensisches RNAs mit Gen-Aktivierung CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2&#039;-O-Methyl RNAs

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...