Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה על באנר שמש המחקר המכון לחקר המוח והגוף תרומות (BBDP) של סאן סיטי, אריזונה לאספקת רקמות המוח האנושי. BBDP נתמך על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (U24 NS072026 המוח הלאומי משאב רקמות למחלת פרקינסון והפרעות קשורות), המכון הלאומי על הזדקנות (P30AG19610 אריזונה מחלת ליבה של אלצהיימר), מחלקת אריזונה של שירותי בריאות (חוזה 211002, אריזונה אלצהיימר מרכז המחקר), הנציבות אריזונה מחקר ביו (חוזים 4001, 0011, 05-901 ו 1001 הקונסורציום מחלת פרקינסון אריזונה) ואת מייקל J. קרן פוקס לחקר פרקינסון27. מחקר זה היה נתמך גם על ידי המולדת ומדינת אריזונה (המענק ADHS ADHS14-052688). אנו מודים גם לאנדריאה שמיט (מחקר באנר) ולסינתיה לצ (TGen) לתמיכה ניהולית.

מחקר זה בוצע בהתאם לכל ההנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם. רקמות המוח הושגו מן המחקר הבריאות השמש המכון מחקר המוח ותרומות הגוף בסאן סיטי, AZ. הפעילות של התוכנית לתרומת המוח והגוף מאושרת על ידי מועצת הביקורת המוסדית המערבית (פרוטוקול ויראל #20120821). כל הנושאים או נציגיה המשפטי...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).</li><li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

במחקר זה, שתי ערכות הכנה לספריות זמינות מסחרית, אפשרויות טרום טיפול, וכמויות קלט RNA נבדקו כדי למטב פרוטוקול העשרה של circRNA לבניית ספריות ברצף של circRNA. בהתבסס על הערכות של מחקר זה, מספר היבטים מרכזיים ושלבים קריטיים ביצירת ספריות רצף של circRNA גלויים לעין. ההערכה שלנו מאשרת את השירות של RNase R טרום ?...

Rnas מעגלית (circrnas) הם אנדוגני, rnas שאינם קידוד שקיבלו תשומת לב באמצעות הביטוי המתפשט שלהם ב-איקריוטית הטרנססקריפט1,2,3. הם נוצרו כאשר exons בחזרה אחד לשני ולכן נחשבו בתחילה להיות החדרת חפצים4,5. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו כי סוג תא מוצג, רקמה, התפתחות ביטוי ספציפי בשלב3,6 והוא שימור אבולוציונית2,3. יתר על כן, הם מעורבים בגישור של חלבון-חלבון אינטראקציות7, מיקרו RNA (mirna) כריכה3,8,9,10, ויסות של שעתוק גן הורים11.
ברצף RNA הקלאסי (RNA-seq), circRNAs עשוי להיות אבוד לחלוטין במהלך בניית הספרייה כתוצאה פולי בחירה של mRNAs או עלול להיות קשה לבודד נתון שלהם שגשוג נמוך. עם זאת, לימודי האפיון האחרונים שילבו צעד טרום טיפול באמצעות rnase R על מנת להעשיר עבור circrna2,12,13. RNase R הוא exoribonuclease כי מעכל RNAs ליניארי, השארת מאחורי מבנים RNA מעגלי. הפרוטוקולים העשרה CircRNA היו ממוטבים על ידי יצירת והשוואת נתונים משני מסחרית זמין שלמות הספרייה ערכות הבנייה, עם וללא צעד RNase R טרום הטיפול, ושימוש בכמויות משתנות של סך RNA קלט (1 עד 4 μg). הפרוטוקול הממוטב נעשה בשלב הבא כדי להעריך את השפע של circrnas על פני חמישה אזורי מוח שונים (המוח השני [BC], האונה הקודקודית [IP], פיתול כישור הזמני האמצעי [MG], קליפת העורף [OC] והפיתול הקדמי העליון [SF]) וארבעה סוגי רקמות אחרים (כבד [LV], ריאה [LU], הלימפה [LN] ו הלבלב [הרשות]). הספריות השונות של RNA מזווגים ברצף והנתונים נותחו באמצעות שישה אלגוריתמים שונים של חיזוי מעגלי: find_circ3, ciri14, מפות15, סכין16, DCC17, ו-circrna18. בהתבסס על האנליזה שלנו, המספר הגבוה ביותר של circRNAs הייחודי זוהה בעת שימוש בערכת הכנה כוללת של הספרייה RNA הכולל עם RNase R טרום הטיפול ו 4 μg כולל הקלט RNA. הפרוטוקול הממוטב מתואר כאן. כפי שדווחו בעבר19,20, העשרת הגבוהים ביותר של circrnas נצפתה במוח לעומת סוגי רקמות אחרות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

RNAs מעגלית (circRNAs) הם מחלקה של RNAs שאינם קידוד מעורב פונקציות כולל מיקרו-RNA (miRNA) רגולציה, גישור של אינטראקציות חלבונים חלבון, ויסות של תמלול הורים. ברצף הקלאסי של RNA הדור הבא (RNA-seq), circRNAs הם בדרך כלל להתעלם כתוצאה מבחירה פולי-A במהלך הבנייה של ספריות mRNA, או מצויים בשפע נמוך מאוד, ולכן קשה לבודד ולזהות. כאן, פרוטוקול בנייה של ספריית circRNA היה מיטבי על ידי השוואת ערכות הכנה לספריות, אפשרויות טרום טיפול וכמויות שונות של קלט RNA. שני מסחרית זמין שלמים הכנה הספרייה ערכות, עם ובלי RNase R טרום טיפול, ושימוש כמויות משתנה של סך RNA קלט (1 כדי 4 μg), נבדקו. לבסוף, מספר סוגי רקמות; כולל כבד, ריאות, לימפה הלימפה, ולבלב; כמו גם אזורי מוח מרובים; כולל המוח העליון, האונה הקודקודית, פיתול הרקה התיכונה, קליפת העורף, והפיתול הקדמי העליון; הושוו להערכת השפע circRNA על פני סוגי רקמות. ניתוח של נתוני ה-RNA-seq שנוצרו באמצעות שישה כלי איתור מסוגים שונים של כלים (find_circ, CIRI, מפות, סכין, DCC ו-Circrna) חשף שערכת הכנה של ספריית RNA הכוללת את הספריה עם RNase R ו-4 μg כניסת RNA היא המיטבית שיטה לזיהוי המספר הקרוב ביותר של circRNAs. בהתאם לממצאים הקודמים, ההעשרה הגבוהה ביותר של circRNAs נצפתה ברקמות המוח לעומת סוגי רקמות אחרים.

נתונים שנוצרו באמצעות שליטה אוניברסלית מסחרית בקרה אוניברסלי (UC) ושימוש בשתי ערכות הכנה לספרייה, שניהם כוללים צעד מחסור ribo בפרוטוקולים שלהם, העריכו לראשונה. באמצעות זרימת עבודה אנליטית (זרימת עבודה של ניתוח נתונים, סעיף 4), כולל, מספר גבוה יותר של circRNAs זוהה בקבוצות הנתונים TruSeq בהשוואה לאלה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

RNAs מעגלית (circRNAs) הם RNAs שאינם מצפינה לקידוד שעשויים להיות בעלי תפקידים ברגולציה ובניהול אינטראקציות מדיה בין חלבונים. בעקבות הערכה של פרמטרים שונים לבניית ספריות רצף circRNA, פרוטוקול הושלם באמצעות הכנה נטוש הכולל הספריה RNA עם RNase R טרום טיפול והוא מוצג כאן.

זיהוי של RNAs מעגלית באמצעות רצפי RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

פרוטוקול זה הוא תוצאה של הערכת היבטים מרכזיים של הכנת ספריית circRNA, כגון סוג ערכה, טיפול R, כמויות קלט והשפעתם על זיהוי circRNA. היא מאפשרת זיהוי circRNA אופטימלי ומספקת נתונים על פרמטרים מתכווננים בהתאם לצרכי המשתמש. זיהוי circRNAs בסוגי מדגם שונים יעזור לנו להבין טוב יותר את התפלגות הביטוי שלהם ומגדיר את הבמה לתיווים התפקיד התפקודי של מולקולות אלה.ניתן להחיל שיטה זו על כל דגימת RNA כוללת. חשוב לשמור דגימות RNA על קרח לפני תחילת הפרוטוקול. להעריך את ערכי RIN ו DV200 על Bioanalyzer Agilent או TapeStation לפני ההכנה, ובצע את ההליכים המתאימים בעת עבודה עם RNA.התחל בדילול ה-RNA הכולל לארבעה מיקרוגרם ב-39 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase והגדלתו מעלה ומטה כדי לערבב. בצינור נפרד, השתמש 1x RNase R Buffer כדי לדלל את R לריכוז עבודה של שתי יחידות לכל microliter. פיפטה 39 microliters של RNA הכולל וחמישה microliters של 10x RNase R תגובה Buffer לתוך צינור תגובה 1.5 מיקרוליטר, ומערבבים.מוסיפים שישה מיקרוליטרים של RNase R.Then מדולל ואז להתאים את פיפטה לנפח תגובה מלא, ומערבבים את הפתרון על ידי צינור למעלה ולמטה 10 פעמים. מניחים את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, מוודאים כי נפח התגובה המלא שקוע באמבט המים. לאחר מכן, מניחים את הצינור על קרח, ומיד להמשיך עם ניקוי RNA וריכוז.לפני ההתחלה, הכינו את מאגר שטיפת ה-RNA על ידי ערבוב התרכיז עם 48 מיליליטר של 100% אתנול, והניחו עמודי טיהור בצינורות איסוף. כאשר אתה מוכן, הוסף שני אמצעי אחסון של מאגר איגוד RNA לדגימה R שטופלה ב- RNase וערבב היטב. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של 100% אתנול לתערובת למשך 300 מיקרוליטרים בסך הכל, העברו את כל אמצעי האחסון לעמודה וצנטריפוגה למשך 30 שניות.הסר את הזרימה דרך, ולהוסיף 400 microliters של מאגר הכנת RNA ישירות לעמודה. צנטריפוגה במשך 30 שניות, ולזרוק את הזרימה דרך. לאחר מכן, להוסיף 700 microliters של מאגר לשטוף RNA לעמודה, צנטריפוגה במשך 30 שניות, ולזרוק את הזרימה דרך.הוסיפו עוד 400 מיקרוליטרים של חיץ הכביסה, צנטריפוגה לשתי דקות, והעברו את העמודה לצינור טרי נטול RNase באורך 1.5 מיליליטר. בזהירות להוסיף 11 microliters של מים ללא RNase ישירות לעמודה על ידי החזקת קצה פיפטה ממש מעל מסנן העמודה. תן את המדגם לשבת במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן צנטריפוגה זה במשך דקה אחת.ודא שיש זרימה דרך הצינור 1.5 מיליליטר, ולזרוק את העמודה. ניתן לאחסן את דגימת ה-RNA המטוהרת במינוס 80 מעלות צלזיוס או להשתמש בה באופן מיידי להכנת הספרייה. העבר 10 מיקרוליטרים של ה-RNA הכולל המטוהר לנקייה בצלחת PCR של 96 באר.הוסף חמישה microliters של מאגר כריכה rRNA ואחריו חמישה microliters של rRNA הסרת תערובת, ולאחר מכן בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את ריאגנטים. לאטום את הצלחת, ולהדחיר אותו במשך חמש דקות ב 68 מעלות צלזיוס על בלוק תרמוצ'ילר מתוכנת מראש וחומם מראש. לאחר הדגירה, תן לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.הסר את החותם מהצלחת, והוסף 35 מיקרוליטרים של מערבולת טמפרטורת החדר rRNA הסרת חרוזים לדגימה. כוונן את הפיפיטה ל-45 מיקרוליטרים, ואת פיגט למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים כדי לערבב ביסודיות. תן לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.מעבירים את הצלחת למצב מגנטי, ודקרים אותה שם לדקה אחת או עד שהפתרון מתבהר. מעבירים את העל-טבעי ל באר חדשה על הצלחת. ואז להעביר את הצלחת מהעמוד המגנטי לדוכן הצלחת.Vortex RNA ניקוי חרוזים עד שהם מפוזרים היטב, ולהוסיף 99 microliters של חרוזים לדגימה. פיפטה למעלה ולמטה לערבב, ו דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מעבירים את הצלחת לעמוד המגנטי, ומשאירים אותה שם במשך חמש דקות או עד שהפתרון מתנקה, ואז מסירים ומשליכים את כל העל-טבעי מה באר.כשהצלחת עדיין על המגנטיות, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של אתנול 80% מוכן טרי לבאגם מבלי לשבש את חרוזים. השאירו את האתנול היטב במשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך אותו. הוסיפו 11 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון ל באר, והוסיפו אותה למעלה ולמטה כדי לערבב.הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות, ולאחר מכן להעביר אותו בחזרה לעמוד המגנטי, ולשמור אותו שם עד הפתרון מתנקה. מעבירים 8.5 מיקרוליטרים של העל-טבעי ל הבאר החדשה על אותה צלחת, ומוסיפים 8.5 מיקרוליטרים של Elute, Primer, Fragment High Mix לכל באר המכילה דגימה. פיפטה מעלה ומטה 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות, לאטום את הצלחת, ולהדחיר אותו במשך שמונה דקות בתרמוצ'יקלר שחומם מראש ל -94 מעלות צלזיוס.מקררים את הדגימה לארבע מעלות צלזיוס, מסירים את הצלחת מהתרמוצ'ילר, וצנטריפוגים אותה לזמן קצר. שתי ערכות הכנה לספרייה, TruSeq ו- KAPA, הוערכו עבור פרוטוקול זה. בסך הכל, מספר גבוה יותר של RNAs מעגליים ואחוז נמוך יותר של RNA ריבוזומלי זוהה בעת שימוש בערכת TruSeq, כך TruSeq נבחר לניסויים נוספים.המשמעות של טיפול מקדים R R R הוערכה על-ידי השוואת הנתונים שנוצרו מספריות מטופלות מראש ולא מטופלות מראש. כצפוי, מספר גבוה יותר של RNAs מעגליים זוהה באופן עקבי בספריות שטופלו מראש בהשוואה לספריות שאינן מטופלות מראש. כמות ה- RNA של הקלט הייתה ממוטבת לזיהוי מגוון גבוה יותר של RNAs מעגליים.ספריות הוכנו באמצעות אחד, שניים וארבעה מיקרוגרם של RNA קלט, ואת המגוון הגבוה ביותר של מיני RNA עגול נצפתה בעת שימוש ארבעה מיקרוגרם של RNA הכולל. הפרוטוקול האופטימי שימש להשוואת שפעי רנ"א מעגליים בחמישה אזורי מוח מארבעה תורמים בריאים ולסוגי רקמות אחרים משישה תורמים בריאים. בסך הכל, שפע גבוה יותר של RNase מעגלי נצפתה במוח בהשוואה לסוגי רקמות אחרים.חשוב לזכור לעקוב אחר נהלים מתאימים בעת עבודה עם RNA, כולל ללבוש כפפות, לנקות ביסודיות את הספסל ואת pipettes עם מגבונים RNase או לרסס לפני תחילת הפרוטוקול, ושמירה על RNA על קרח מראש. לאחר הליך זה, ניתן לבצע אימות אורתוגונלי כגון רצף סנגר של צמתים circRNA מזוהים. הגילוי של circRNAs חדשים וראיות נוספות של נוכחותם גילוף את תחום חדש של מחקר לחקר הפונקציות הביולוגיות שלהם.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic ניתוח<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA רצף נתונים באמצעות Suite טוקסידו על פרויקט גלקסי

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing RNAs Noncoding זמן באמצעות הפעלת גנים CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...