Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
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हम मानव मस्तिष्क ऊतकों के प्रावधान के लिए सूर्य शहर, एरिजोना के बैनर सूर्य स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान मस्तिष्क और शरीर दान कार्यक्रम (BBDP) के लिए आभारी हैं । BBDP को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डरएंड स्ट्रोक (पार्किंसंस डिजीज एंड संबंधित विकारों के लिए U24 NS072026 नेशनल ब्रेन एंड टिश्यू रिसोर्स), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (P30AG19610 एरिजोना अल्जाइमर डिजीज कोर सेंटर), एरिजोना डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ सर्विसेज (कॉन्ट्रैक्ट 211002, एरिजोना अल्जाइमर अनुसंधान केंद्र), एरिजोना जैव चिकित्सा अनुसंधान आयोग (अनुबंध ४००१, 0011, 05-901 और १००१ एरिजोना पार्किंसंस रोग कंसोर्टियम के लिए) और माइकल जे । पार्किंसंस रिसर्च27के लिए फॉक्स फाउंडेशन । इस अध्ययन को डीएचएस और एरिजोना राज्य (एडीएचएस अनुदान # ADHS14-052688) द्वारा भी समर्थित किया गया था। हम प्रशासनिक सहायता के लिए एंड्रिया श्मिट (बैनर रिसर्च) और सिंथिया लेचुगा (टीजेन) को भी धन्यवाद देते हैं ।

यह शोध मानव कल्याण के लिए सभी संस्थागत, राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के अनुपालन में किया गया है । मस्तिष्क ऊतकों सूर्य शहर, AZ में बैनर सूर्य स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान मस्तिष्क और शरीर द?...

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	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

इस अध्ययन में, सिरआरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों के निर्माण के लिए एक सर्आरएनए संवर्धन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय तैयारकरने किट, पूर्व-उपचार विकल्प, और इनपुट...

परिपत्र आरएनए (सीआईआरसीआरएनए) एंडोजेनस, नॉन-कोडिंग आरएनए हैं जिन्होंने यूकेरियोटिक ट्रांसक्रिप्टोम1,2,3में अपनी व्यापक अभिव्यक्ति को देखते हुए ध्यान प्राप्त किया है। वे तब बनते हैं जब एक-दूसरे को वापस-स्प्लिस करते हैं और इसलिए शुरू में4,5की कलाकृतियां स्प्लिसिंग मानी जाती थीं । हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सर्क्रैना सेल प्रकार, ऊतक और विकासात्मक चरण विशिष्ट अभिव्यक्ति3,6 प्रदर्शित करते हैं और विकासवादी रूप से संरक्षितहैं 2,3। इसके अलावा, वे प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन7,माइक्रो-आरएनए (मिरना) बाध्यकारी3,8,9,10और माता-पिता के जीन ट्रांसक्रिप्शन11के नियमन की मध्यस्थता में शामिल हैं।
शास्त्रीय आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) में, एमआरएनआरए के लिए पॉली-ए चयन के परिणामस्वरूप पुस्तकालय निर्माण के दौरान सिरक्रैना पूरी तरह से खो सकता है या उनकी कम बहुतायत को देखते हुए अलग करना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, हाल ही में सर्आरएनए लक्षण वर्णन अध्ययनों ने RNase आर का उपयोग करके एक पूर्व-उपचार कदम को शामिल किया है ताकि सर्कराना2,12,13के लिए समृद्ध किया जा सके। RNase R एक एक्सोरिजोन्यूकलीज है जो रैलियक आरएनए को पचाता है, जो परिपत्र आरएनए संरचनाओं को पीछे छोड़ता है। सिरआरएनए संवर्धन प्रोटोकॉल को दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरे ट्रांसपेटोम लाइब्रेरी निर्माण किट से डेटा उत्पन्न करने और तुलना करके अनुकूलित किया गया था, साथ और बिना एक RNase आर पूर्व उपचार चरण के बिना, और कुल आरएनए इनपुट (1 से 4 ग्राम) की अलग-अलग मात्रा का उपयोग करके। अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग अगले पांच विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों (सेरिबैलम [ईसा पूर्व], अवर पार्श्व पालि [आईपी], मध्य लौकिक जायरस [एमजी], ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स [ओसी] और बेहतर ललाट जाइरस [एसएफ]) और चार अन्य ऊतक प्रकारों (जिगर [एलवी], फेफड़े [एलयू], लिम्फ नोड [एलएन] और अग्न्याशय [पीए]) में सिरिआरएनए की बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । आरएनए-सीक्यू पुस्तकालयों को अंतिम अनुक्रमित जोड़ा गया और डेटा का विश्लेषण छह अलग-अलग सर्आरएनए भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग करके किया गया: find_circ3,सीआईआरआई14,मैप्सप्लिस15,चाकू16,डीसीसी17और सीआईआरसीएक्सप्लोरर18। हमारे विश्लेषण के आधार पर, रैनसे आर प्री-ट्रीटमेंट और 4 μg कुल इनपुट आरएनए के साथ एक फंसे कुल आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करते समय अद्वितीय सर्करनास की उच्चतम संख्या का पता लगाया गया था। अनुकूलित प्रोटोकॉल यहां वर्णित है। जैसा कि पहले19,20की रिपोर्ट थी, अन्य ऊतक प्रकारों की तुलना में मस्तिष्क में सिरक्रैना का उच्चतम संवर्धन देखा गया था।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

सर्कुलर आरएनए (सर्क्रैना) माइक्रो-आरएनए (मिरना) नियमन, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की मध्यस्थता और माता-पिता के जीन ट्रांसक्रिप्शन के नियमन सहित कार्यों में शामिल गैर-कोडिंग आरएनए का एक वर्ग है। शास्त्रीय अगली पीढ़ी आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) में, सिरआरएनए को आमतौर पर एमआरएनए पुस्तकालयों के निर्माण के दौरान पॉली-ए चयन के परिणामस्वरूप अनदेखा किया जाता है, या बहुत कम बहुतायत में पाया जाता है, और इसलिए अलग-थलग और पता लगाना मुश्किल होता है। यहां, पुस्तकालय तैयार करने की किट, पूर्व उपचार विकल्प और विभिन्न कुल आरएनए इनपुट राशि की तुलना करके एक सिरआरएनए पुस्तकालय निर्माण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरे ट्रांसक्रिप्टोम लाइब्रेरी तैयारकरने किट, के साथ और RNase आर पूर्व उपचार के बिना, और कुल आरएनए इनपुट (1 से 4 μg) की चर मात्रा का उपयोग कर, परीक्षण किया गया । अंत में, कई ऊतक प्रकार; जिगर, फेफड़े, लिम्फ नोड, और अग्न्याशय सहित; साथ ही कई मस्तिष्क क्षेत्रों; जिसमें सेरिबैलम, अवर पार्श्व पालि, मध्यम लौकिक जायरस, ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स, और बेहतर ललाट जाइरस शामिल हैं; ऊतक प्रकारों में सिरआरएनए बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए तुलना की गई थी। छह अलग-अलग सिरआरएनए डिटेक्शन टूल (find_circ, सीआईआई, मैप्सप्लिस, नाइफ, डीसीसी और सीआईआरसीएक्सप्लोरर) का उपयोग करके उत्पन्न आरएनए-सीक्यू डेटा के विश्लेषण से पता चला कि आरएनसे आर प्री-ट्रीटमेंट और 4ग्राम आरएनए इनपुट के साथ एक फंसे कुल आरएनए लाइब्रेरी तैयारकरने किट इष्टतम है सर्क्रैना की उच्चतम सापेक्ष संख्या की पहचान करने के लिए विधि। पिछले निष्कर्षों के अनुरूप, अन्य ऊतक प्रकारों की तुलना में मस्तिष्क के ऊतकों में सर्केना का उच्चतम संवर्धन देखा गया था।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यूनिवर्सल कंट्रोल आरएनए (यूसी) का उपयोग करके उत्पन्न डेटा और दो पुस्तकालय तैयार करने की किट का उपयोग करके, जिनमें से दोनों में उनके प्रोटोकॉल में एक राइबो-कमी कदम शामिल है, पहले...

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Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

परिपत्र आरएनए (सर्क्रैना) गैर-कोडिंग आरएनए हैं जिनमें प्रोटीन के बीच प्रतिलेखन विनियमन और मध्यस्थता बातचीत में भूमिकाएं हो सकती हैं। सर्आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों के निर्माण के लिए विभिन्न मापदंडों के मूल्यांकन के बाद, एक प्रोटोकॉल RNase आर पूर्व उपचार के साथ फंसे कुल आरएनए पुस्तकालय की तैयारी का उपयोग संकलित किया गया था और यहां प्रस्तुत किया जाता है ।

आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करके परिपत्र आरएनए की पहचान

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

यह प्रोटोकॉल परिरना लाइब्रेरी तैयार करने के प्रमुख पहलुओं का मूल्यांकन करने का परिणाम है, जैसे किट प्रकार, RNase आर उपचार, इनपुट मात्रा और परिरना का पता लगाने पर उनका प्रभाव। यह इष्टतम परिरना का पता लगाने में सक्षम बनाता है और उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर समायोज्य मापदंडों पर डेटा प्रदान करता है। विभिन्न नमूना प्रकारों में परसीआरएन की पहचान करने से हमें उनकी अभिव्यक्ति के वितरण को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी और इन अणुओं की कार्यात्मक भूमिका को चित्रित करने के लिए मंच सेट किया जाएगा ।इस विधि को किसी भी कुल आरएनए नमूने पर लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले बर्फ पर आरएनए के नमूने रखना महत्वपूर्ण है। तैयारी से पहले फुर्तीला बायोएनालाइजर या टेपस्टेशन पर RIN और DV200 मूल्यों का आकलन करें, और आरएनए के साथ काम करते समय उचित प्रक्रियाओं का पालन करें।RNase मुक्त पानी के ३९ माइक्रोलीटर में चार माइक्रोग्राम के लिए कुल आरएनए को कमजोर करने और मिश्रण करने के लिए इसे ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा शुरू करते हैं । एक अलग ट्यूब में, 1x RNase आर बफर का उपयोग करने के लिए RNase आर माइक्रोलीटर प्रति दो इकाइयों की एक काम एकाग्रता को कमजोर । पिपेट कुल आरएनए के 39 माइक्रोलीटर और 10x RNase R रिएक्शन बफर के पांच माइक्रोलीटर 1.5 माइक्रोलीटर रिएक्शन ट्यूब में, और मिश्रण।पतला RNase R.के छह माइक्रोलीटर जोड़ें तो पूर्ण प्रतिक्रिया मात्रा के लिए पिपेट समायोजित करें, और ऊपर और नीचे 10 बार पाइपिंग द्वारा समाधान मिश्रण । ट्यूब को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि पूर्ण प्रतिक्रिया की मात्रा पानी के स्नान में डूबी हुई है। फिर, ट्यूब को बर्फ पर रखें, और तुरंत आरएनए सफाई और एकाग्रता के साथ आगे बढ़ें।शुरू करने से पहले, 100% इथेनॉल के 48 मिलीलीटर के साथ ध्यान केंद्रित करके आरएनए वॉश बफर तैयार करें, और शुद्धिकरण कॉलम को संग्रह ट्यूबों में रखें। जब तैयार हो, आरएनएई आर-इलाज नमूने में आरएनए बाइंडिंग बफर के दो संस्करण जोड़ें, और अच्छी तरह से मिलाएं। कुल 300 माइक्रोलीटर के लिए मिश्रण में 100% इथेनॉल के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें, पूरे वॉल्यूम को कॉलम में स्थानांतरित करें, और 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र करें।प्रवाह के माध्यम से निकालें, और सीधे कॉलम में आरएनए प्रेप बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। फिर, कॉलम में आरएनए वॉश बफर के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें, 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र करें, और प्रवाह को त्याग दें।वॉश बफर के एक और 400 माइक्रोलीटर जोड़ें, दो मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और कॉलम को एक ताजा RNase-मुक्त 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। ध्यान से कॉलम फिल्टर के ठीक ऊपर पिपेट टिप पकड़ कर सीधे कॉलम में RNase-मुक्त पानी के 11 माइक्रोलीटर जोड़ें । नमूना कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए बैठते हैं, और फिर यह एक मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ।सुनिश्चित करें कि 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह है, और कॉलम को त्यागें। शुद्ध आरएनए नमूने को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या पुस्तकालय तैयार करने के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है। शुद्ध कुल आरएनए के 10 माइक्रोलीटर को 96-अच्छी पीसीआर प्लेट में एक साफ कुएं में स्थानांतरित करें।RRNA बाध्यकारी बफर के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें RRNA हटाने मिश्रण के पांच माइक्रोलीटर के बाद, तो धीरे ऊपर और नीचे पाइप के लिए reagents मिश्रण । प्लेट को सील करें, और इसे प्रीप्रोग्राम्ड और प्रीहीटेड थर्मोसाइकिलर ब्लॉक पर 68 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, प्लेट को एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें।प्लेट से सील निकालें, और नमूने में भंवर कमरे के तापमान आरएनए हटाने मोतियों के 35 माइक्रोलीटर जोड़ें। पिपेट को 45 माइक्रोलीटर में समायोजित करें, और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 10 से 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। प्लेट को एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें।प्लेट को चुंबकीय स्टैंड पर स्थानांतरित करें, और इसे एक मिनट के लिए या जब तक समाधान साफ नहीं हो जाता है तब तक इसे इनक्यूबेट करें। सुपरनेट को प्लेट पर नए कुएं में स्थानांतरित करें। इसके बाद प्लेट को मैग्नेटिक स्टैंड से प्लेट स्टैंड पर ट्रांसफर करें।भंवर आरएनए मोतियों को तब तक साफ करता है जब तक कि वे अच्छी तरह से तितर-बितर न हो जाएं, और नमूने में मोतियों के 99 माइक्रोलीटर जोड़ें। पिपेट को मिश्रण करने के लिए, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। प्लेट को चुंबकीय स्टैंड पर स्थानांतरित करें, और इसे पांच मिनट के लिए छोड़ दें या जब तक समाधान साफ नहीं हो जाता है, तब तक सभी सुपरनैंट को कुएं से हटा दें और त्याग दें।चुंबकीय स्टैंड पर अभी भी प्लेट के साथ, मोतियों को बाधित किए बिना कुएं में तैयार 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। इथेनॉल को 30 सेकंड के लिए कुएं में छोड़ दें, फिर इसे हटा दें और त्याग दें। अच्छी तरह से एल्यूशन बफर के 11 माइक्रोलीटर जोड़ें, और इसे मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट, तो यह चुंबकीय स्टैंड को वापस स्थानांतरित, और यह वहां रखने के लिए जब तक समाधान साफ करता है । एक ही प्लेट पर एक नए कुएं में सुपरनेटेंट के 8.5 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें, और एक नमूना युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से एल्यूट, प्राइमर, टुकड़ा हाई मिक्स के 8.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट, प्लेट को सील करें, और इसे थर्मोसाइकिलर में आठ मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।नमूना को चार डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, थर्मोसाइकिलर से प्लेट निकालें, और इसे संक्षेप में अपकेंद्री करें। इस प्रोटोकॉल के लिए दो पुस्तकालय तैयारी किट, TruSeq और KAPA का आकलन किया गया था। कुल मिलाकर, ट्रूसेक किट का उपयोग करते समय परिपत्र आरएनए की अधिक संख्या और रिबोसोमल आरएनए का कम प्रतिशत पाया गया, इसलिए ट्रूसेक़ को आगे के प्रयोगों के लिए चुना गया था।पूर्वउपचारित और गैर-पूर्वउपचारित पुस्तकालयों से उत्पन्न आंकड़ों की तुलना करके RNase आर प्रीट्रीटमेंट के महत्व का मूल्यांकन किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, गैर-पूर्वअनुचारित लोगों की तुलना में पूर्वअनुचारित पुस्तकालयों में परिपत्र आरएनए की एक उच्च संख्या की लगातार पहचान की गई थी। परिपत्र आरएनए की उच्च विविधता का पता लगाने के लिए इनपुट आरएनए की मात्रा को अनुकूलित किया गया था।पुस्तकालयों को एक, दो और चार माइक्रोग्राम इनपुट आरएनए का उपयोग करके तैयार किया गया था, और कुल आरएनए के चार माइक्रोग्राम का उपयोग करते समय परिपत्र आरएनए प्रजातियों की उच्चतम विविधता देखी गई थी। अनुकूलित प्रोटोकॉल चार स्वस्थ दाताओं से पांच मस्तिष्क क्षेत्रों में परिपत्र आरएनए बहुतायत की तुलना करने के लिए और छह स्वस्थ दाताओं से अंय ऊतक प्रकार के लिए इस्तेमाल किया गया था । कुल मिलाकर, अन्य ऊतक प्रकारों की तुलना में मस्तिष्क में परिपत्र आरएनएएस की उच्च बहुतायत देखी गई।आरएनए के साथ काम करते समय उचित प्रक्रियाओं का पालन करना याद रखना महत्वपूर्ण है, जिसमें दस्ताने पहनना, प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले बेंच और पिपेट को आरएनएसई वाइप्स या स्प्रे के साथ अच्छी तरह से साफ करना और पहले से बर्फ पर आरएनए रखना शामिल है। इस प्रक्रिया के बाद, ऑर्थोगोनल सत्यापन जैसे पहचाने गए परिरना जंक्शनों के सेंगर अनुक्रमण किया जा सकता है। नए परसीआरएनए की खोज और उनकी उपस्थिति के आगे के सबूत उनके जैविक कार्यों की खोज के लिए अनुसंधान के एक नए क्षेत्र को तराशते हैं।

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

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वैश्विक बायोटिनिलेटेड Psoralen का उपयोग आरएनए-आरएनए अंतरण मैपिंग

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Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

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की transcriptomic विश्लेषण<em&gt; स</em&gt;।<em&gt; एलिगेंस</emआकाशगंगा परियोजना पर टक्सेडो सूट के माध्यम से&gt; शाही सेना अनुक्रमण डाटा

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

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RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

चयापचय लेबलिंग और स्थानांतरण RNAs Macroarrays का उपयोग कर की रूपरेखा

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Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

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&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

त्रुटि-सही डीएनए और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग कर दुर्लभ घटना का पता लगाने

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)

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Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

लंबे noncoding rnas का उपयोग करके overexpressing जीन सक्रिय crispr

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

पूरे रक्त से mRNA के अनुक्रमण नैनोकोर अनुक्रमण का उपयोग

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...