Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
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Siamo grati al Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) di Sun City, Arizona, per la fornitura di tessuti cerebrali umani. Il BBDP è stato supportato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), il National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona's Disease Core Center), l'Arizona Department of Health Services (contratto 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), Arizona Biomedical Research Commission (contratti 4001, 0011, 05-901 e 1001 per l'Arizona Parkinson's Disease Consortium) e il Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research27. Questo studio è stato sostenuto anche dal DHS e dallo Stato dell'Arizona (ADHS grant - ADHS14-052688). Ringraziamo anche Andrea Schmitt (Banner Research) e Cynthia Lechuga (TGen) per il supporto amministrativo.

Questa ricerca è stata condotta nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. I tessuti cerebrali sono stati ottenuti dal Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program a Sun City, a. Le operazioni del Brain and Body Donation Program sono approvate dal Western Institutional Review Board (protocollo WIRB #20120821). Tutti i soggetti o i loro rappresentanti legali hanno firmato il consenso informato. Le biocampionie commerciali (non cerebrali) ...

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	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

In questo studio sono stati testati due kit di preparazione della libreria disponibili in commercio, opzioni di pre-trattamento e quantità di RNA di input al fine di ottimizzare un protocollo di arricchimento del circRNA per la costruzione di librerie di sequenziamento del circRNA. Sulla base delle valutazioni di questo studio, sono evidenti una serie di aspetti chiave e passaggi critici nella creazione di librerie di sequenziamento degli xml circolr. La nostra valutazione conferma l'utilità del pretrattamento di RNase...

Gli RNA circolari (CircRNA) sono RNA endogeni e non codificanti che hanno guadagnato attenzione data la loro espressione pervasiva nel trascrittoma eucarotico1,2,3. Si formano quando gli esoni si ricongiungino l'uno con l'altro e quindi sono stati inizialmente considerati artefatti di giunzione4,5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che i circRNA presentano il tipo di cellula, il tessuto e l'espressione specifica dello stadio di sviluppo3,6 e sono evolutivamente conservati2,3. Inoltre, sono coinvolti nella mediazione delle interazioni proteina7, microRNA (miRNA) legame3,8,9,10, e la regolazione della trascrizione genica parentale11.
Nel sequenziamento dell'RNA classico (RNA-seq), i circRNA possono essere completamente persi durante la costruzione della biblioteca a causa della selezione poli-A per gli mRNA o possono essere difficili da isolare data la loro bassa abbondanza. Tuttavia, recenti studi di caratterizzazione degli anni 'rcRNA hanno incorporato una fase di pre-trattamento utilizzando RNase R al fine di arricchire per i circRNA2,12,13. RNase R è un exoribonucleolaga che digerisce gli RNA lineari, lasciando dietro di sé strutture circolari di RNA. I protocolli di arricchimento di CircRNA sono stati ottimizzati generando e confrontando i dati di due kit di costruzione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza una fase di pretrattamento di RNase R, e utilizzando quantità variabili di input totale di RNA (da 1 a 4 g). Il protocollo ottimizzato è stato successivamente utilizzato per valutare l'abbondanza di circRNA in cinque diverse regioni del cervello (cervelletto [BC], lobo parietale inferiore [IP], giro temporale medio [MG], corteccia occipitale [OC] e giro frontale superiore [SF]) e altri quattro tipi di tessuto (fegato [LV], polmone [LU], nodo linfoficio [LN]). Le librerie RNA-seq sono state accoppiate fine sequenziate e i dati sono stati analizzati utilizzando sei diversi algoritmi di previsione di circRNA: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17e CIRCexplorer18. Sulla base della nostra analisi, il numero più alto di circRNA unici è stato rilevato quando si utilizza un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilata con pre-trattamento RNase R e 4 RNA di input totale. Il protocollo ottimizzato è descritto qui. Come riportato in precedenza19,20, il più alto arricchimento di circRNA è stato osservato nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Gli RNA circolari (circRNA) sono una classe di RNA non codificanti coinvolti in funzioni tra cui la regolazione del microRNA (miRNA), la mediazione delle interazioni proteina-proteina e la regolazione della trascrizione genica parentale. Nel sequenziamento dell'RNA di nuova generazione (RNA-seq) classico, i circolrRNA sono tipicamente trascurati come risultato della selezione poli-A durante la costruzione di librerie di mRNA, o si trovano a un'abbondanza molto bassa e sono quindi difficili da isolare e rilevare. In questo caso, un protocollo di costruzione della libreria di circRNA è stato ottimizzato confrontando kit di preparazione della libreria, opzioni di pretrattamento e varie quantità totali di ingresso di RNA. Sono stati testati due kit di preparazione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza RNase R pre-trattamento, e utilizzando quantità variabili di ingresso totale di RNA (da 1 a 4 g). Infine, più tipi di tessuto; tra cui fegato, polmone, linfonodo e pancreas; così come più regioni cerebrali; tra cui il cervelletto, il lobo parietale inferiore, il giro temporale medio, la corteccia occipitale e il giro frontale superiore; sono stati confrontati per valutare l'abbondanza di circRNA tra i tipi di tessuto. L'analisi dei dati generati in RNA-seq utilizzando sei diversi strumenti di rilevamento degli RNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) ha rivelato che un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilato con pretrattamento RNase R e 4 g di ingresso in RNA è l'ottimale per identificare il numero relativo più elevato di circRNA. Coerentemente con i risultati precedenti, il più alto arricchimento dei circRNA è stato osservato nei tessuti cerebrali rispetto ad altri tipi di tessuti.

I dati generati utilizzando un RNA di controllo universale (UC) disponibile in commercio e utilizzando due kit di preparazione della libreria, entrambi inclusi entrambi una fase di deplezione nei loro protocolli, sono stati valutati per la prima volta. Utilizzando un flusso di lavoro analitico (flusso di lavoro di analisi dei dati, sezione 4), nel complesso, è stato rilevato un numero maggiore di circRNA nei set di dati TruSeq rispetto a quelli Kapa (Figura 1). Sebbene le percentuali di RNA...

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Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Gli RNA circolari (circRNA) sono RNA non codificanti che possono avere ruoli nella regolazione trascrizionale e nelle interazioni di mediazione tra proteine. A seguito della valutazione di diversi parametri per la costruzione di librerie di sequenziamento di circuitRNA, è stato compilato un protocollo che utilizza la preparazione della libreria totale di RNA spiaggiata con il pretrattamento di RNase R ed è presentato qui.

Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Questo protocollo è il risultato della valutazione degli aspetti chiave della preparazione della libreria di circRNA, come il tipo di kit, il trattamento RNasi R, le quantità di input e il loro impatto sul rilevamento dell'circRNA. Consente un rilevamento ottimale dell'circRNA e fornisce dati su parametri regolabili a seconda delle esigenze dell'utente. Identificare i circRNA in diversi tipi di campioni ci aiuterà a comprendere meglio la distribuzione della loro espressione e prepara il palcoscenico per delineare il ruolo funzionale di queste molecole.Questo metodo può essere applicato a qualsiasi campione totale di RNA. È importante mantenere i campioni di RNA sul ghiaccio prima di iniziare il protocollo. Valutare i valori RIN e DV200 sul Bioanalyzer Agilent o su TapeStation prima della preparazione e seguire le procedure appropriate quando si lavora con l'RNA.Inizia diluire l'RNA totale a quattro microgrammi in 39 microlitri di acqua priva di RNasi e tubazioni su e giù per mescolare. In un tubo separato, utilizzare 1x RNasi R Buffer per diluire la RNasi R ad una concentrazione di lavoro di due unità per microlitro. Pipetta 39 microlitri di RNA totale e cinque microlitri di 10x RNasi R Reaction Buffer in un tubo di reazione da 1,5 microlitri e mescolare.Aggiungere sei microlitri della RNasi R.Diluita Quindi regolare la pipetta a pieno volume di reazione e mescolare la soluzione tubazione su e giù 10 volte. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per 10 minuti, assicurandosi che l'intero volume di reazione sia immerso nel bagno d'acqua. Quindi, posizionare il tubo sul ghiaccio e procedere immediatamente con la pulizia e la concentrazione dell'RNA.Prima di iniziare, preparare l'RNA Wash Buffer mescolando il concentrato con 48 millilitri di etanolo al 100% e posizionare le colonne di purificazione in tubi di raccolta. Quando è pronto, aggiungere due volumi di RNA Binding Buffer al campione trattato con RNasi R e mescolare bene. Aggiungere 150 microlitri di etanolo al 100% alla miscela per un totale di 300 microlitri, trasferire l'intero volume nella colonna e centrifugare per 30 secondi.Rimuovere il flusso e aggiungere 400 microlitri di RNA Prep Buffer direttamente alla colonna. Centrifugare per 30 secondi e scartare il flusso. Quindi, aggiungere 700 microlitri di RNA Wash Buffer alla colonna, centrifugare per 30 secondi e scartare il flusso attraverso.Aggiungere altri 400 microlitri del Wash Buffer, centrifugare per due minuti e trasferire la colonna in un tubo fresco privo di RNasi da 1,5 millilitri. Aggiungere con cura 11 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente alla colonna tenendo la punta della pipetta proprio sopra il filtro colonna. Lasciare riposare il campione per un minuto a temperatura ambiente, quindi centrifugarlo per un minuto.Assicurarsi che vi sia flusso nel tubo da 1,5 millilitri e scartare la colonna. Il campione di RNA purificato può essere conservato a meno 80 gradi Celsius o utilizzato immediatamente per la preparazione della libreria. Trasferire 10 microlitri dell'RNA totale purificato in un pozzo pulito in una piastra PCR da 96 po'.Aggiungere cinque microlitri di rRNA Binding Buffer seguiti da cinque microlitri di rRNA Removal Mix, quindi pipettare delicatamente su e giù per mescolare i reagenti. Sigillare la piastra e incubarla per cinque minuti a 68 gradi Celsius su un blocco termociclore preprogrammato e preriscaldato. Dopo l'incubazione, lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per un minuto.Rimuovere la guarnizione dalla piastra e aggiungere 35 microlitri di perline di rimozione dell'rRNA a temperatura ambiente vorticose al campione. Regolare la pipetta a 45 microlitri e pipettare su e giù da 10 a 20 volte per mescolare accuratamente. Lasciare riposare il piatto a temperatura ambiente per un minuto.Trasferire la piastra su un supporto magnetico e incubarla lì per un minuto o fino a quando la soluzione non si sgombrà. Trasferire il supernatante in un nuovo pozzo sul piatto. Quindi trasferire la piastra dal supporto magnetico al supporto della piastra.Perline di pulizia dell'RNA vortice fino a quando non sono ben disperse e aggiungere 99 microlitri di perline al campione. Pipettare su e giù per mescolare e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire la piastra sul supporto magnetico e lasciarla lì per cinque minuti o fino a quando la soluzione non si libera, quindi rimuovere e scartare tutto il supernatante dal pozzo.Con la piastra ancora sul supporto magnetico, aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato all'80% al pozzo senza interrompere le perline. Lasciare l'etanolo nel pozzo per 30 secondi, quindi rimuoverlo e scartarlo. Aggiungere 11 microlitri di Elution Buffer al pozzo e pipettarlo su e giù per mescolare.Incubare la piastra a temperatura ambiente per due minuti, quindi trasferirla di nuovo sul supporto magnetico e tenerla lì fino a quando la soluzione non si sgombrò. Trasferire 8,5 microlitri del supernatante in un nuovo pozzo sulla stessa piastra e aggiungere 8,5 microlitri di Elute, Primer, Fragment High Mix ad ogni pozzo contenente un campione. Pipettare su e giù 10 volte per mescolare accuratamente, sigillare la piastra e incubarla per otto minuti in un termociclo preriscaldato a 94 gradi Celsius.Raffreddare il campione a quattro gradi Celsius, rimuovere la piastra dal termociclo e centrifugarla brevemente. Due kit di preparazione della biblioteca, TruSeq e KAPA, sono stati valutati per questo protocollo. Nel complesso, un maggior numero di RNA circolari e una percentuale inferiore di RNA ribosomiale sono stati rilevati quando si utilizza il kit TruSeq, quindi TruSeq è stato selezionato per ulteriori esperimenti.L'importanza del pretrattamento RNase R è stata valutata confrontando i dati generati da librerie pretrattate e non pretrattate. Come previsto, nelle librerie pretrattate è stato costantemente identificato un numero maggiore di RNA circolari rispetto a quelle non pretrattate. La quantità di RNA di ingresso è stata ottimizzata per rilevare una maggiore diversità di RNA circolari.Le librerie erano preparate usando uno, due e quattro microgrammi di RNA in ingresso, e la più alta diversità di specie di RNA circolari è stata osservata quando si usano quattro microgrammi di RNA totale. Il protocollo ottimizzato è stato utilizzato per confrontare l'abbondanza di RNA circolare in cinque regioni cerebrali da quattro donatori sani e per altri tipi di tessuti da sei donatori sani. Nel complesso, una maggiore abbondanza di RNasi circolare è stata osservata nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto.È importante ricordare di seguire le procedure appropriate quando si lavora con l'RNA, incluso indossare guanti, pulire accuratamente la panca e le pipette con salviette o spray RNasi prima di iniziare il protocollo e mantenere l'RNA sul ghiaccio in anticipo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire la convalida ortogonale come il sequenziamento Sanger delle giunzioni di circRNA identificate. La scoperta di nuovi circRNA e un'ulteriore prova della loro presenza ritagliano una nuova area di ricerca per esplorare le loro funzioni biologiche.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Ricerca

Genetica

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