Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
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Siamo grati al Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) di Sun City, Arizona, per la fornitura di tessuti cerebrali umani. Il BBDP è stato supportato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), il National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona's Disease Core Center), l'Arizona Department of Health Services (contratto 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), Arizona Biomedical Research Commission (contratti 4001, 0011, 05-901 e 1001 per l'Arizona Parkinson's Disease Consortium) e il Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research27. Questo studio è stato sostenuto anche dal DHS e dallo Stato dell'Arizona (ADHS grant - ADHS14-052688). Ringraziamo anche Andrea Schmitt (Banner Research) e Cynthia Lechuga (TGen) per il supporto amministrativo.

Questa ricerca è stata condotta nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. I tessuti cerebrali sono stati ottenuti dal Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program a Sun City, a. Le operazioni del Brain and Body Donation Program sono approvate dal Western Institutional Review Board (protocollo WIRB #20120821). Tutti i soggetti o i loro rappresentanti legali hanno firmato il consenso informato. Le biocampionie commerciali (non cerebrali) ...

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	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

In questo studio sono stati testati due kit di preparazione della libreria disponibili in commercio, opzioni di pre-trattamento e quantità di RNA di input al fine di ottimizzare un protocollo di arricchimento del circRNA per la costruzione di librerie di sequenziamento del circRNA. Sulla base delle valutazioni di questo studio, sono evidenti una serie di aspetti chiave e passaggi critici nella creazione di librerie di sequenziamento degli xml circolr. La nostra valutazione conferma l'utilità del pretrattamento di RNase...

Gli RNA circolari (CircRNA) sono RNA endogeni e non codificanti che hanno guadagnato attenzione data la loro espressione pervasiva nel trascrittoma eucarotico1,2,3. Si formano quando gli esoni si ricongiungino l'uno con l'altro e quindi sono stati inizialmente considerati artefatti di giunzione4,5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che i circRNA presentano il tipo di cellula, il tessuto e l'espressione specifica dello stadio di sviluppo3,6 e sono evolutivamente conservati2,3. Inoltre, sono coinvolti nella mediazione delle interazioni proteina7, microRNA (miRNA) legame3,8,9,10, e la regolazione della trascrizione genica parentale11.
Nel sequenziamento dell'RNA classico (RNA-seq), i circRNA possono essere completamente persi durante la costruzione della biblioteca a causa della selezione poli-A per gli mRNA o possono essere difficili da isolare data la loro bassa abbondanza. Tuttavia, recenti studi di caratterizzazione degli anni 'rcRNA hanno incorporato una fase di pre-trattamento utilizzando RNase R al fine di arricchire per i circRNA2,12,13. RNase R è un exoribonucleolaga che digerisce gli RNA lineari, lasciando dietro di sé strutture circolari di RNA. I protocolli di arricchimento di CircRNA sono stati ottimizzati generando e confrontando i dati di due kit di costruzione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza una fase di pretrattamento di RNase R, e utilizzando quantità variabili di input totale di RNA (da 1 a 4 g). Il protocollo ottimizzato è stato successivamente utilizzato per valutare l'abbondanza di circRNA in cinque diverse regioni del cervello (cervelletto [BC], lobo parietale inferiore [IP], giro temporale medio [MG], corteccia occipitale [OC] e giro frontale superiore [SF]) e altri quattro tipi di tessuto (fegato [LV], polmone [LU], nodo linfoficio [LN]). Le librerie RNA-seq sono state accoppiate fine sequenziate e i dati sono stati analizzati utilizzando sei diversi algoritmi di previsione di circRNA: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17e CIRCexplorer18. Sulla base della nostra analisi, il numero più alto di circRNA unici è stato rilevato quando si utilizza un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilata con pre-trattamento RNase R e 4 RNA di input totale. Il protocollo ottimizzato è descritto qui. Come riportato in precedenza19,20, il più alto arricchimento di circRNA è stato osservato nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Gli RNA circolari (circRNA) sono una classe di RNA non codificanti coinvolti in funzioni tra cui la regolazione del microRNA (miRNA), la mediazione delle interazioni proteina-proteina e la regolazione della trascrizione genica parentale. Nel sequenziamento dell'RNA di nuova generazione (RNA-seq) classico, i circolrRNA sono tipicamente trascurati come risultato della selezione poli-A durante la costruzione di librerie di mRNA, o si trovano a un'abbondanza molto bassa e sono quindi difficili da isolare e rilevare. In questo caso, un protocollo di costruzione della libreria di circRNA è stato ottimizzato confrontando kit di preparazione della libreria, opzioni di pretrattamento e varie quantità totali di ingresso di RNA. Sono stati testati due kit di preparazione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza RNase R pre-trattamento, e utilizzando quantità variabili di ingresso totale di RNA (da 1 a 4 g). Infine, più tipi di tessuto; tra cui fegato, polmone, linfonodo e pancreas; così come più regioni cerebrali; tra cui il cervelletto, il lobo parietale inferiore, il giro temporale medio, la corteccia occipitale e il giro frontale superiore; sono stati confrontati per valutare l'abbondanza di circRNA tra i tipi di tessuto. L'analisi dei dati generati in RNA-seq utilizzando sei diversi strumenti di rilevamento degli RNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) ha rivelato che un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilato con pretrattamento RNase R e 4 g di ingresso in RNA è l'ottimale per identificare il numero relativo più elevato di circRNA. Coerentemente con i risultati precedenti, il più alto arricchimento dei circRNA è stato osservato nei tessuti cerebrali rispetto ad altri tipi di tessuti.

I dati generati utilizzando un RNA di controllo universale (UC) disponibile in commercio e utilizzando due kit di preparazione della libreria, entrambi inclusi entrambi una fase di deplezione nei loro protocolli, sono stati valutati per la prima volta. Utilizzando un flusso di lavoro analitico (flusso di lavoro di analisi dei dati, sezione 4), nel complesso, è stato rilevato un numero maggiore di circRNA nei set di dati TruSeq rispetto a quelli Kapa (Figura 1). Sebbene le percentuali di RNA...

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Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Gli RNA circolari (circRNA) sono RNA non codificanti che possono avere ruoli nella regolazione trascrizionale e nelle interazioni di mediazione tra proteine. A seguito della valutazione di diversi parametri per la costruzione di librerie di sequenziamento di circuitRNA, è stato compilato un protocollo che utilizza la preparazione della libreria totale di RNA spiaggiata con il pretrattamento di RNase R ed è presentato qui.

Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Questo protocollo è il risultato della valutazione degli aspetti chiave della preparazione della libreria di circRNA, come il tipo di kit, il trattamento RNasi R, le quantità di input e il loro impatto sul rilevamento dell'circRNA. Consente un rilevamento ottimale dell'circRNA e fornisce dati su parametri regolabili a seconda delle esigenze dell'utente. Identificare i circRNA in diversi tipi di campioni ci aiuterà a comprendere meglio la distribuzione della loro espressione e prepara il palcoscenico per delineare il ruolo funzionale di queste molecole.Questo metodo può essere applicato a qualsiasi campione totale di RNA. È importante mantenere i campioni di RNA sul ghiaccio prima di iniziare il protocollo. Valutare i valori RIN e DV200 sul Bioanalyzer Agilent o su TapeStation prima della preparazione e seguire le procedure appropriate quando si lavora con l'RNA.Inizia diluire l'RNA totale a quattro microgrammi in 39 microlitri di acqua priva di RNasi e tubazioni su e giù per mescolare. In un tubo separato, utilizzare 1x RNasi R Buffer per diluire la RNasi R ad una concentrazione di lavoro di due unità per microlitro. Pipetta 39 microlitri di RNA totale e cinque microlitri di 10x RNasi R Reaction Buffer in un tubo di reazione da 1,5 microlitri e mescolare.Aggiungere sei microlitri della RNasi R.Diluita Quindi regolare la pipetta a pieno volume di reazione e mescolare la soluzione tubazione su e giù 10 volte. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per 10 minuti, assicurandosi che l'intero volume di reazione sia immerso nel bagno d'acqua. Quindi, posizionare il tubo sul ghiaccio e procedere immediatamente con la pulizia e la concentrazione dell'RNA.Prima di iniziare, preparare l'RNA Wash Buffer mescolando il concentrato con 48 millilitri di etanolo al 100% e posizionare le colonne di purificazione in tubi di raccolta. Quando è pronto, aggiungere due volumi di RNA Binding Buffer al campione trattato con RNasi R e mescolare bene. Aggiungere 150 microlitri di etanolo al 100% alla miscela per un totale di 300 microlitri, trasferire l'intero volume nella colonna e centrifugare per 30 secondi.Rimuovere il flusso e aggiungere 400 microlitri di RNA Prep Buffer direttamente alla colonna. Centrifugare per 30 secondi e scartare il flusso. Quindi, aggiungere 700 microlitri di RNA Wash Buffer alla colonna, centrifugare per 30 secondi e scartare il flusso attraverso.Aggiungere altri 400 microlitri del Wash Buffer, centrifugare per due minuti e trasferire la colonna in un tubo fresco privo di RNasi da 1,5 millilitri. Aggiungere con cura 11 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente alla colonna tenendo la punta della pipetta proprio sopra il filtro colonna. Lasciare riposare il campione per un minuto a temperatura ambiente, quindi centrifugarlo per un minuto.Assicurarsi che vi sia flusso nel tubo da 1,5 millilitri e scartare la colonna. Il campione di RNA purificato può essere conservato a meno 80 gradi Celsius o utilizzato immediatamente per la preparazione della libreria. Trasferire 10 microlitri dell'RNA totale purificato in un pozzo pulito in una piastra PCR da 96 po'.Aggiungere cinque microlitri di rRNA Binding Buffer seguiti da cinque microlitri di rRNA Removal Mix, quindi pipettare delicatamente su e giù per mescolare i reagenti. Sigillare la piastra e incubarla per cinque minuti a 68 gradi Celsius su un blocco termociclore preprogrammato e preriscaldato. Dopo l'incubazione, lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per un minuto.Rimuovere la guarnizione dalla piastra e aggiungere 35 microlitri di perline di rimozione dell'rRNA a temperatura ambiente vorticose al campione. Regolare la pipetta a 45 microlitri e pipettare su e giù da 10 a 20 volte per mescolare accuratamente. Lasciare riposare il piatto a temperatura ambiente per un minuto.Trasferire la piastra su un supporto magnetico e incubarla lì per un minuto o fino a quando la soluzione non si sgombrà. Trasferire il supernatante in un nuovo pozzo sul piatto. Quindi trasferire la piastra dal supporto magnetico al supporto della piastra.Perline di pulizia dell'RNA vortice fino a quando non sono ben disperse e aggiungere 99 microlitri di perline al campione. Pipettare su e giù per mescolare e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire la piastra sul supporto magnetico e lasciarla lì per cinque minuti o fino a quando la soluzione non si libera, quindi rimuovere e scartare tutto il supernatante dal pozzo.Con la piastra ancora sul supporto magnetico, aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato all'80% al pozzo senza interrompere le perline. Lasciare l'etanolo nel pozzo per 30 secondi, quindi rimuoverlo e scartarlo. Aggiungere 11 microlitri di Elution Buffer al pozzo e pipettarlo su e giù per mescolare.Incubare la piastra a temperatura ambiente per due minuti, quindi trasferirla di nuovo sul supporto magnetico e tenerla lì fino a quando la soluzione non si sgombrò. Trasferire 8,5 microlitri del supernatante in un nuovo pozzo sulla stessa piastra e aggiungere 8,5 microlitri di Elute, Primer, Fragment High Mix ad ogni pozzo contenente un campione. Pipettare su e giù 10 volte per mescolare accuratamente, sigillare la piastra e incubarla per otto minuti in un termociclo preriscaldato a 94 gradi Celsius.Raffreddare il campione a quattro gradi Celsius, rimuovere la piastra dal termociclo e centrifugarla brevemente. Due kit di preparazione della biblioteca, TruSeq e KAPA, sono stati valutati per questo protocollo. Nel complesso, un maggior numero di RNA circolari e una percentuale inferiore di RNA ribosomiale sono stati rilevati quando si utilizza il kit TruSeq, quindi TruSeq è stato selezionato per ulteriori esperimenti.L'importanza del pretrattamento RNase R è stata valutata confrontando i dati generati da librerie pretrattate e non pretrattate. Come previsto, nelle librerie pretrattate è stato costantemente identificato un numero maggiore di RNA circolari rispetto a quelle non pretrattate. La quantità di RNA di ingresso è stata ottimizzata per rilevare una maggiore diversità di RNA circolari.Le librerie erano preparate usando uno, due e quattro microgrammi di RNA in ingresso, e la più alta diversità di specie di RNA circolari è stata osservata quando si usano quattro microgrammi di RNA totale. Il protocollo ottimizzato è stato utilizzato per confrontare l'abbondanza di RNA circolare in cinque regioni cerebrali da quattro donatori sani e per altri tipi di tessuti da sei donatori sani. Nel complesso, una maggiore abbondanza di RNasi circolare è stata osservata nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto.È importante ricordare di seguire le procedure appropriate quando si lavora con l'RNA, incluso indossare guanti, pulire accuratamente la panca e le pipette con salviette o spray RNasi prima di iniziare il protocollo e mantenere l'RNA sul ghiaccio in anticipo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire la convalida ortogonale come il sequenziamento Sanger delle giunzioni di circRNA identificate. La scoperta di nuovi circRNA e un'ulteriore prova della loro presenza ritagliano una nuova area di ricerca per esplorare le loro funzioni biologiche.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Ricerca

Genetica

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

Etichettatura metabolica e profilatura di RNA di trasferimento utilizzando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Che overexpressing lunghi non codificanti RNA utilizzando CRISPR Gene-attivante

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2&#039;-O-Methyl RNAs

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...