Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Vi er takknemlige for banner Søn Health Research Institute Brain and Body donasjon program (BBDP) av Sun City, Arizona for levering av menneskelige hjernevev. Den BBDP har blitt støttet av National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag (U24 NS072026 National Brain og vev Resource for Parkinsons sykdom og relaterte lidelser), National Institute on aging (P30AG19610 Arizona Alzheimers sykdom Core Center), Arizona Department of Health Services (kontrakt 211002, Arizona Alzheimers Research Center), Arizona Biomedical Research Commission (kontrakter 4001, 0011, 05-901 og 1001 til Arizona Parkinson ' s Disease Consortium) og Michael J. Fox Foundation for Parkinsons forskning27. Denne studien ble også støttet av DHS og staten Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). Vi takker også Andrea Schmitt (banner Research) og Cynthia Lechuga (TGen) for Administrativ støtte.

Denne forskningen er utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Brain vev ble innhentet fra banner Søn Health Research Institute Brain og Body donasjon program i Sun City, AZ. Driften av Brain and Body donasjon program er godkjent av Western institusjonelle Review Board (WIRB protokollen #20120821). Alle eller deres juridiske representanter undertegnet informert samtykke. Kommersielle (ikke-hjerne) biospecimens ble kjøpt fra Proteogenex.
<p class=...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).</li><li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

I denne studien, to kommersielt tilgjengelige bibliotek forberedelse kits, pre-behandling alternativer, og innspill RNA beløpene ble testet for å optimalisere en circRNA berikelse protokoll for bygging av circRNA sekvensering biblioteker. Basert på vurderingen til denne studien, er en rekke viktige aspekter og kritiske trinn for å opprette circRNA sekvensering biblioteker åpenbare. Vår evaluering bekrefter nytten av RNase R pre-behandling, som gjenspeiles av det økte antallet circRNAs oppdaget. Generelt sett ble d...

Sirkulær RNAs (CircRNAs) er endogene, ikke-koding RNAs som har fått oppmerksomhet gitt deres gjennomgående uttrykk i eukaryote transcriptome1,2,3. De dannes når exoner back-skjøte til hverandre og dermed ble i utgangspunktet anses å være skjøting gjenstander4,5. Men nyere studier har vist at circRNAs utstillingen celle type, vev, og utviklingsmessige scenen spesifikke uttrykk3,6 og er evolutionarily bevart2,3. Videre er de involvert i mekling av protein-protein interaksjoner7, mikro-RNA (miRNA) binding3,8,9,10, og regulering av foreldrenes genet transkripsjon11.
I klassisk RNA sekvensering (RNA-SEQ), circRNAs kan være helt tapt under biblioteket konstruksjon som et resultat av Poly-et utvalg for mRNAs eller kan være vanskelig å isolere gitt sin lave overflod. Men nylig circRNA karakterisering studier har innarbeidet en pre-Treatment trinn ved hjelp RNase R for å berike for circRNAs2,12,13. RNase R er en exoribonuclease som fordøyer lineær RNAs, og etterlater sirkulære RNA-strukturer. CircRNA berikelse protokoller ble optimalisert ved å generere og sammenligne data fra to kommersielt tilgjengelige hele transcriptome biblioteket konstruksjon kits, med og uten en RNase R pre-Treatment trinn, og ved hjelp av varierende mengder av total RNA input (1 til 4 μg). Den optimaliserte protokollen ble neste brukt til å evaluere overflod av circRNAs over fem forskjellige hjernen regioner (lillehjernen [BC], mindreverdig parietal flik [IP], midt Temporal gyrus [MG], occipital cortex [OC] og overlegen frontal gyrus [SF]) og fire andre vev typer (lever [LV], lunge [LU], lymfeknuter [LN] og bukspyttkjertel [PA]). RNA-SEQ bibliotekene ble sammenkoblet slutten sekvensert og data ble analysert ved hjelp av seks forskjellige circRNA prediksjon algoritmer: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, Knife16, DCC17, og CIRCexplorer18. Basert på vår analyse ble det høyeste antallet unike circRNAs oppdaget ved bruk av et strandet total RNA-biblioteks Forberedelses sett med RNase R forbehandling og 4 μg total inngang RNA. Den optimaliserte protokollen er beskrevet her. Som tidligere rapportert19,20, den høyeste berikelse av circRNAs ble observert i hjernen i forhold til andre typer vev.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Circular RNAs (circRNAs) er en klasse av ikke-koding RNAs involvert i funksjoner, inkludert Micro-RNA (miRNA) regulering, formidling av protein-protein interaksjoner, og regulering av foreldrenes genet transkripsjon. I klassisk neste generasjon RNA sekvensering (RNA-SEQ), circRNAs er vanligvis oversett som følge av Poly-et utvalg under byggingen av mRNA biblioteker, eller finnes ved svært lav overflod, og er derfor vanskelig å isolere og oppdage. Her, en circRNA biblioteket konstruksjon protokollen ble optimalisert ved å sammenligne biblioteket forberedelse kits, forbehandling alternativer og ulike totale RNA input beløp. To kommersielt tilgjengelige hele transcriptome bibliotek Forberedelses sett, med og uten RNase R forbehandling, og ved hjelp av variable mengder totalt RNA-inngang (1 til 4 μg), ble testet. Til slutt, flere vevstyper; inkludert lever, lunge, lymfe node, og bukspyttkjertel; så vel som flere hjerneregioner; inkludert lillehjernen, mindreverdig parietal flik, midt Temporal gyrus, occipital cortex, og overlegen frontal gyrus; sammenlignet med å evaluere circRNA overflod på tvers av vevstyper. Analyse av de genererte RNA-SEQ-dataene ved hjelp av seks forskjellige circRNA gjenkjenningsverktøy (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC og CIRCexplorer) avslørte at en strandet total RNA-biblioteks Forberedelses sett med RNase R forbehandling og 4 μg RNA-inngang er den optimale metode for å identifisere det høyeste relative antallet circRNAs. I samsvar med tidligere funn, den høyeste berikelse av circRNAs ble observert i hjernen vev i forhold til andre typer vev.

Data generert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig universell kontroll RNA (UC) og bruk av to biblioteks Forberedelses sett, som begge inkluderer et Ribo-trinn i protokollene, ble først vurdert. Ved hjelp av en analytisk arbeidsflyt (arbeidsflyt for data analyse, del 4), samlet, ble et høyere antall circRNAs oppdaget i TruSeq datasett sammenlignet med de kapa de (figur 1). Selv om ribosomal RNA (rRNA) prosenter var under 5% i datasett fra begge settene for lavere input beløp (1, 2 UG)...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Sirkulær RNAs (circRNAs) er ikke-koding RNAs som kan ha roller i transcriptional regulering og formidling interaksjoner mellom proteiner. Etter vurdering av ulike parametre for bygging av circRNA sekvensering biblioteker, en protokoll ble kompilert utnytte strandet total RNA biblioteket forberedelse med RNase R pre-behandling og er presentert her.

Identifikasjon av sirkulær RNAs ved hjelp av RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Denne protokollen er et resultat av å evaluere viktige aspekter ved circRNA bibliotek forberedelse, for eksempel kit type, RNase R behandling, inngangsbeløp og deres innvirkning på circRNA deteksjon. Det muliggjør optimal circRNA-deteksjon og gir data om justerbare parametere avhengig av brukerens behov. Identifisering av circRNAs i forskjellige utvalgstyper vil hjelpe oss med å bedre forstå fordelingen av uttrykket deres og setter scenen for å avgrense de funksjonelle rollen til disse molekylene.Denne metoden kan brukes på alle totale RNA-eksempler. Det er viktig å holde RNA-prøver på is før protokollen startes. Vurder RIN- og DV200-verdiene på Agilent Bioanalyzer eller TapeStation før forhåndsforberedelse, og følg passende prosedyrer når du arbeider med RNA.Begynn med å fortynne totalt RNA til fire mikrogram i 39 mikroliter RNase-fritt vann og pipetter det opp og ned for å blande. I et separat rør bruker du 1x RNase R Buffer til å fortynne RNase R til en arbeidskonsentrasjon på to enheter per mikroliter. Pipette 39 mikroliter av totalt RNA og fem mikroliter på 10x RNase R reaksjonsbuffer i et reaksjonsrør på 1,5 mikroliter, og bland.Tilsett seks mikroliter av den fortynnede RNase R.Juster deretter pipetten til fullt reaksjonsvolum, og bland løsningen ved å pipetter opp og ned 10 ganger. Plasser røret i et 37-graders Celsius vannbad i 10 minutter, og sørg for at hele reaksjonsvolumet er nedsenket i vannbadet. Deretter plasserer du røret på is, og fortsett umiddelbart med RNA-opprydding og konsentrasjon.Før du starter, klargjør RNA Wash Buffer ved å blande konsentratet med 48 milliliter med 100% etanol, og plasser rensekolonner i oppsamlingsrør. Når du er klar, legger du til to binderingsbuffer for RNA i RNase R-behandlet prøve og blander godt. Tilsett 150 mikroliter med 100% etanol til blandingen for totalt 300 mikroliter, overfør hele volumet til kolonnen og sentrifuge i 30 sekunder.Fjern flyten gjennom, og legg til 400 mikroliter RNA Prep Buffer direkte i kolonnen. Sentrifuge i 30 sekunder, og kast strømmen gjennom. Deretter legger du til 700 mikroliter RNA-vaskebuffer i kolonnen, sentrifuge i 30 sekunder og kast strømmen gjennom.Legg til ytterligere 400 mikroliter av vaskebufferen, sentrifuge i to minutter, og overfør kolonnen til et friskt RNase-fritt 1,5-milliliter rør. Tilsett forsiktig 11 mikroliter RNase-fritt vann direkte til kolonnen ved å holde pipettespissen rett over kolonnefilteret. La prøven sitte i ett minutt ved romtemperatur, og sentrifuge den i ett minutt.Kontroller at det er gjennomstrømning i 1,5-milliliter røret, og kast kolonnen. Den rensede RNA-prøven kan lagres ved minus 80 grader Celsius eller brukes umiddelbart til bibliotekforberedelse. Overfør 10 mikroliter av den rensede totale RNA til en ren brønn i en 96-brønns PCR-plate.Tilsett fem mikroliter rRNA Binding Buffer etterfulgt av fem mikroliter rRNA Removal Mix, og pipette deretter forsiktig opp og ned for å blande reagensene. Forsegle platen, og inkuber den i fem minutter ved 68 grader Celsius på en forhåndsprogrammert og forvarmet termocyclerblokk. Etter inkubasjonen, la platen sitte ved romtemperatur i ett minutt.Fjern forseglingen fra platen, og tilsett 35 mikroliter av vortexed romtemperatur rRNA fjerning perler til prøven. Juster pipetten til 45 mikroliter, og pipetten opp og ned 10 til 20 ganger for å blandes grundig. La platen sitte ved romtemperatur i ett minutt.Overfør platen til et magnetisk stativ, og inkuber den der i ett minutt eller til løsningen klargjør. Overfør det overnaturlige til ny brønn på tallerkenen. Overfør deretter platen fra magnetstativet til platestativet.Vortex RNA opprydding perler til de er godt dispergert, og tilsett 99 mikroliter perler til prøven. Pipetten opp og ned for å blande, og inkubere platen ved romtemperatur i 10 minutter. Overfør platen til magnetstativet, og la den stå der i fem minutter eller til løsningen klarner, og fjern og kast alle overnaturlige fra brønnen.Med platen fortsatt på magnetstativet, legg til 200 mikroliter med nylaget 80% etanol til brønnen uten å forstyrre perlene. La etanol i brønnen stå i 30 sekunder, fjern og kast den. Tilsett 11 mikroliter elutionbuffer til brønnen, og pipetter den opp og ned for å blande.Inkuber platen ved romtemperatur i to minutter, og overfør den deretter tilbake til magnetstativet, og hold den der til løsningen er klar. Overfør 8,5 mikroliter av supernatanten til en ny brønn på samme plate, og tilsett 8,5 mikroliter Elute, Primer, Fragment High Mix til hver brønn som inneholder en prøve. Pipetten opp og ned 10 ganger for å blande grundig, forsegle platen og inkubere den i åtte minutter i en termocycler forvarmet til 94 grader Celsius.Avkjøl prøven til fire grader Celsius, fjern platen fra termocycleren, og sentrifuger den kort. To bibliotekforberedelsessett, TruSeq og KAPA, ble vurdert for denne protokollen. Samlet sett ble det påvist et høyere antall sirkulære RNA-er og lavere prosentandel ribosomal RNA ved bruk av TruSeq-settet, så TruSeq ble valgt for videre eksperimenter.Betydningen av RNase R-forbehandling ble evaluert ved å sammenligne dataene som genereres fra forbehandlede og ikke-forhåndsbehandlede biblioteker. Som forventet ble et høyere antall sirkulære RNA-er konsekvent identifisert i de forbehandlede bibliotekene sammenlignet med ikke-forhåndsbehandlede. Mengden input RNA ble optimalisert for å oppdage et høyere mangfold av sirkulære RNAAer.Bibliotekene ble utarbeidet ved hjelp av ett, to og fire mikrogram input RNA, og det høyeste mangfoldet av sirkulære RNA-arter ble observert ved bruk av fire mikrogram totalt RNA. Den optimaliserte protokollen ble brukt til å sammenligne sirkulære RNA overflod i fem hjerneregioner fra fire friske givere og for andre vevstyper fra seks friske givere. Samlet sett ble en høyere overflod av sirkulære RNase observert i hjernen sammenlignet med andre vevstyper.Det er viktig å huske å følge passende prosedyrer når du arbeider med RNA, inkludert bruk av hansker, grundig rengjøring av benken og pipetter med RNase kluter eller spray før du begynner protokollen, og holde RNA på is på forhånd. Etter denne prosedyren kan ortogonal validering som Sanger sekvensering av identifiserte circRNA-veikryss utføres. Oppdagelsen av nye circRNAs og ytterligere bevis på deres tilstedeværelse skjærer ut et nytt forskningsområde for å utforske deres biologiske funksjoner.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Analyse av Transcriptomic<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA sekvenseringsdata Gjennom Tuxedo Suite på Galaxy-prosjektet

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-spesifikke og selektiv anerkjennelse av Double-strandet RNAs over Single-strandet RNAs av kjemisk endret peptid nukleinsyrer

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolsk merking og profilering av overføring RNAs bruker Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing lang Noncoding RNAs med aktivering av Gene CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA fra hele Blood bruke Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...