Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
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Estamos gratos ao Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) de Sun City, Arizona para o fornecimento de tecidos cerebrais humanos. O BBDP tem sido apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), o National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), o Arizona Department of Health Services (contrato 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), o Arizona Biomedical Research Commission (contratos 4001, 0011, 05-901 e 1001 para o Arizona Parkinson's Disease Consortium) e michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research27. Este estudo também foi apoiado pelo DHS e pelo Estado do Arizona (concessão adhs # ADHS14-052688). Agradecemos também a Andrea Schmitt (Banner Research) e Cynthia Lechuga (TGen) pelo apoio administrativo.

Esta pesquisa tem sido realizada em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Os tecidos cerebrais foram obtidos a partir do Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program em Sun City, AZ. As operações do Programa de Doação de Cérebros e Corpos são aprovadas pelo Western Institutional Review Board (protocolo WIRB #20120821). Todos os sujeitos ou seus representantes legais assinaram o consentimento informado. Bioespécimes comerciai...

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	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

Neste estudo, dois kits de preparação de bibliotecas comercialmente disponíveis, opções de pré-tratamento e quantidades de RNA de entrada foram testados para otimizar um protocolo de enriquecimento circRNA para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA. Com base nas avaliações deste estudo, uma série de aspectos-chave e medidas críticas na criação de bibliotecas de sequenciamento circRNA são aparentes. Nossa avaliação confirma a utilidade do pré-tratamento RNase R, como refletido pelo aument...

RNAs circulares (CircRNAs) são RNAs endógenos e não codificadores que ganharam atenção dada a sua expressão generalizada no transcriptoma eucariótico1,2,3. Eles são formados quando exons back-splice uns aos outros e, portanto, foram inicialmente considerados como estandecendo artefatos4,5. No entanto, estudos recentes demonstraram que circRNAs exibem espécies, tecidos e expressão específica em estágio de desenvolvimento3,6 e são conservadas evolutivamente2,3. Além disso, eles estão envolvidos na mediação de interações proteína-proteína7, micro-RNA (miRNA) ligação3,8,9,10, e regulação da transcrição do gene parental11.
No sequenciamento clássico de RNA (RNA-seq), os circRNAs podem estar completamente perdidos durante a construção da biblioteca como resultado da seleção poli-A para mRNAs ou podem ser difíceis de isolar, dada a sua baixa abundância. No entanto, estudos recentes de caracterização circRNA incorporaram uma etapa pré-tratamento usando RNase R, a fim de enriquecer para circRNAs2,12,13. RNase R é um exoribonuclease que digere RNAs lineares, deixando para trás estruturas circulares de RNA. Os protocolos de enriquecimento da CircRNA foram otimizados gerando e comparando dados de dois kits de construção de bibliotecas de transcriptoma inteiras comercialmente disponíveis, com e sem uma etapa pré-tratamento RNase R, e usando quantidades variáveis de entrada total de RNA (1 a 4 μg). O protocolo otimizado foi usado em seguida para avaliar a abundância de circRNAs em cinco regiões cerebrais diferentes (cerebelo [BC], lobo parietal inferior [IP], giro temporal médio [MG], córtex occipital [OC] e giro frontal superior [SF]) e quatro outros tipos de tecido (fígado [LV], pulmão [LU], nólina [LN] e pancreas [PA]). As bibliotecas de RNA-seq foram emparelhadas sequenciadas e os dados foram analisados usando seis algoritmos diferentes de previsão circRNA: find_circ3,CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17,e CIRCexplorer18. Com base em nossa análise, o maior número de circRNAs únicas foi detectado ao usar um kit de preparação total da biblioteca de RNA com pré-tratamento RNase R e RNA de entrada total de 4 μg. O protocolo otimizado é descrito aqui. Como relatado anteriormente19,20, o maior enriquecimento de circRNAs foi observado no cérebro em comparação com outros tipos de tecido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

RnAs circulares (circRNAs) são uma classe de RNAs não codificadores envolvidos em funções como regulação de microRNA (miRNA), mediação de interações proteína-proteína e regulação da transcrição do gene parental. Na próxima geração clássica de sequenciamento de RNA (RNA-seq), os circRNAs são tipicamente negligenciados como resultado da seleção poli-A durante a construção de bibliotecas de mRNA, ou são encontrados em abundância muito baixa e, portanto, são difíceis de isolar e detectar. Aqui, um protocolo de construção da biblioteca circRNA foi otimizado comparando kits de preparação de bibliotecas, opções de pré-tratamento e vários valores totais de insumos de RNA. Dois kits de preparação de bibliotecas de transcriptoma inteira comercialmente disponíveis, com e sem pré-tratamento RNase R, e usando quantidades variáveis de entrada total de RNA (1 a 4 μg), foram testados. Por último, vários tipos de tecido; incluindo fígado, pulmão, nólina linfática e pâncreas; bem como várias regiões cerebrais; incluindo o cerebelo, o lóbulo parietal inferior, o giro temporal médio, o córtex occipital e o giro frontal superior; foram comparados para avaliar a abundância circRNA em todos os tipos de tecido. A análise dos dados gerados de RNA-seq usando seis ferramentas diferentes de detecção de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) revelou que um kit de preparação total de biblioteca de RNA encalhado com pré-tratamento RNase R e 4 μg de entrada de RNA é o ideal método para identificar o maior número relativo de circRNAs. Consistente com os resultados anteriores, o maior enriquecimento de circRNAs foi observado em tecidos cerebrais em comparação com outros tipos de tecido.

Os dados gerados usando um RNA universal comercialmente disponível do controle (UC) e usando dois jogos da preparação da biblioteca, ambos que incluem uma etapa do ribo-esgotamento em seus protocolos, foram avaliados primeiramente. Usando um fluxo de trabalho analítico (fluxo de trabalho de análise de dados, seção 4), em geral, um maior número de circRNAs foi detectado nos conjuntos de dados truseq em comparação com os Kapa(Figura 1). Embora os percentuais de RNA ribossômico (rRNA...

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Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

RNAs circulares (circRNAs) são RNAs não codificadores que podem ter papéis na regulação transcricional e mediar interações entre proteínas. Após a avaliação de diferentes parâmetros para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA, um protocolo foi compilado utilizando a preparação total da biblioteca de RNA com o pré-tratamento RNase R e é apresentado aqui.

Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Este protocolo é o resultado da avaliação de aspectos-chave da preparação da biblioteca circRNA, como tipo de kit, tratamento RNase, quantidades de entrada e seu impacto na detecção de circRNA. Permite a detecção ideal de circRNA e fornece dados sobre parâmetros ajustáveis, dependendo das necessidades do usuário. Identificar circRNAs em diferentes tipos de amostras nos ajudará a entender melhor a distribuição de sua expressão e prepara o cenário para delinear o papel funcional dessas moléculas.Este método pode ser aplicado a qualquer amostra total de RNA. É importante manter amostras de RNA no gelo antes de iniciar o protocolo. Avalie os valores RIN e DV200 no Agilent Bioanalyzer ou TapeStation antes da preparação, e siga os procedimentos apropriados ao trabalhar com RNA.Comece diluindo o RNA total para quatro microgramas em 39 microliters de água sem RNase e pipetting-lo para cima e para baixo para misturar. Em um tubo separado, use 1x RNase R Buffer para diluir o RNase R para uma concentração de trabalho de duas unidades por microliter. Pipeta 39 microliters de RNA total e cinco microliters de 10x RNase R Reaction Buffer em um tubo de reação de 1,5 microliter, e misturar.Adicione seis microliters do RNase diluído R.Em seguida, ajuste a pipeta ao volume total de reação e misture a solução pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Coloque o tubo em um banho de água Celsius de 37 graus por 10 minutos, certificando-se de que o volume total de reação esteja imerso no banho de água. Em seguida, coloque o tubo no gelo, e prossiga imediatamente com a limpeza e concentração do RNA.Antes de começar, prepare o RNA Wash Buffer misturando o concentrado com 48 mililitros de 100% etanol, e coloque colunas de purificação em tubos de coleta. Quando estiver pronto, adicione dois volumes de tampão de ligação de RNA à amostra r-tratada r-tratada r e misture bem. Adicione 150 microliters de 100% de etanol à mistura para um total de 300 microliters, transfira todo o volume para a coluna e centrífuga por 30 segundos.Remova o fluxo através e adicione 400 microliters de RNA Prep Buffer diretamente à coluna. Centrifugar por 30 segundos, e descartar o fluxo através. Em seguida, adicione 700 microliters de RNA Wash Buffer à coluna, centrífuga por 30 segundos e descarte o fluxo através.Adicione mais 400 microliters do Wash Buffer, centrífuga por dois minutos e transfira a coluna para um tubo 1.5 mililitro fresco sem RNase. Adicione cuidadosamente 11 microliters de água sem RNase diretamente à coluna, segurando a ponta da pipeta bem acima do filtro da coluna. Deixe a amostra descansar por um minuto à temperatura ambiente e, em seguida, centrifuá-la por um minuto.Certifique-se de que há fluxo através do tubo de 1,5 mililitro, e descarte a coluna. A amostra de RNA purificada pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius ou usada imediatamente para a preparação da biblioteca. Transfira 10 microliters do RNA total purificado para um poço limpo em uma placa PCR de 96 poços.Adicione cinco microliters de tampão de ligação rRNA seguido por cinco microliters de rRNA Removal Mix, em seguida, delicadamente pipeta para cima e para baixo para misturar os reagentes. Sele a placa e incuba-a por cinco minutos a 68 graus Celsius em um bloco termocicr pré-programado e pré-aquecido. Após a incubação, deixe a placa ficar em temperatura ambiente por um minuto.Remova o selo da placa e adicione 35 microliters de contas de remoção de rRNA de temperatura ambiente vórtice à amostra. Ajuste a pipeta para 45 microliters, e pipeta para cima e para baixo 10 a 20 vezes para misturar completamente. Deixe o prato ficar em temperatura ambiente por um minuto.Transfira a placa para um suporte magnético e incuba-a lá por um minuto ou até que a solução se limpe. Transfira o supernatante para um novo poço na placa. Em seguida, transfira a placa do suporte magnético para o suporte da placa.As contas de limpeza do Vortex RNA até que estejam bem dispersas e adicionem 99 microliters de contas à amostra. Pipeta para cima e para baixo para misturar, e incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira a placa para o suporte magnético, e deixe-a lá por cinco minutos ou até que a solução se limpe, depois remova e descarte todo o supernatante do poço.Com a placa ainda no suporte magnético, adicione 200 microliters de 80% de etanol recém-preparado ao poço sem interromper as contas. Deixe o etanol no poço por 30 segundos, depois retire e descarte. Adicione 11 microliters de Amortecedor de Elução ao poço, e pipete-o para cima e para baixo para misturar.Incubar a placa em temperatura ambiente por dois minutos, depois transfira-a de volta para o suporte magnético e mantenha-a lá até que a solução se limpe. Transfira 8,5 microliters do supernante para um novo poço na mesma placa, e adicione 8,5 microliters de Elute, Primer, Fragment High Mix para cada poço contendo uma amostra. Pipeta para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem, selar a placa e incuba-la por oito minutos em um termociclador pré-aquecido a 94 graus Celsius.Esfrie a amostra a quatro graus Celsius, remova a placa do termociclador e centrífugue-a brevemente. Dois kits de preparação da biblioteca, TruSeq e KAPA, foram avaliados para este protocolo. No geral, foi detectado um maior número de RNAs circulares e menor percentual de RNA ribossômico ao usar o kit TruSeq, de modo que truseq foi selecionado para outros experimentos.A significância do pré-tratamento Rnase R foi avaliada comparando-se os dados gerados a partir de bibliotecas pré-tratadas e não pré-tratadas. Como esperado, um maior número de RNAs circulares foi consistentemente identificado nas bibliotecas pré-tratadas em comparação com as não pré-tratadas. A quantidade de RNA de entrada foi otimizada para detectar uma maior diversidade de RNAs circulares.As bibliotecas foram preparadas utilizando um, dois e quatro microgramas de RNA de entrada, e a maior diversidade de espécies circulares de RNA foi observada ao utilizar quatro microgramas de RNA total. O protocolo otimizado foi utilizado para comparar abundâncias circulares de RNA em cinco regiões cerebrais de quatro doadores saudáveis e para outros tipos de tecidos de seis doadores saudáveis. No geral, observou-se maior abundância de RNase circular no cérebro em comparação com outros tipos de tecido.É importante lembrar de seguir os procedimentos apropriados ao trabalhar com RNA, incluindo usar luvas, limpar completamente o banco e pipetas com lenços rnase ou spray antes de iniciar o protocolo, e manter o RNA no gelo de antemão. Após este procedimento, pode ser realizada validação ortogonal, como o sequenciamento Sanger de junções circRNA identificadas. A descoberta de novas circRNAs e mais evidências de sua presença esculpiram uma nova área de pesquisa para explorar suas funções biológicas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Análise transcriptomic de<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequenciação de dados através da Suíte Tuxedo no Projeto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Superexpressão de tempo não-codificante RNAs usando CRISPR ativando o Gene

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...