Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Мы благодарны Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) из Сан-Сити, штат Аризона, за предоставление тканей мозга человека. BBDP была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (U24 NS072026 Национальный мозг и ткани ресурс для болезни Паркинсона и связанных с ними расстройств), Национальный институт по проблемам старения (P30AG19610 Аризона болезнь Альцгеймера Основной центр), Аризона Департамент здравоохранения (контракт 211002, Аризона Альцгеймера исследовательский центр), Аризона биомедицинских исследований комиссии (контракты 4001, 0011, 05-901 и 1001 в Аризоне Паркинсона болезни консорциума) и Майкл J. Фокс Фонд исследований Паркинсона27. Это исследование было также поддержано DHS и штата Аризона (ADHS гранта ADHS14-052688). Мы также благодарим Андреа Шмитт (Banner Research) и Синтию Лечуга (TGen) за административную поддержку.

Это исследование проводилось в соответствии со всеми институциональными, национальными и международными руководящими принципами в области благосостояния человека. Мозг ткани были получены из Баннер Солнце Здравоохранения научно-исследовательский институт мозга и тела Пожертвован?...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).</li><li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

В этом исследовании были протестированы два коммерчески доступных комплекта для подготовки библиотек, варианты предварительной обработки и количество входной РНК для оптимизации протокола обогащения циркрнки для строительства библиотек секвенирования циркрнки. На основе оценок эт...

Круговые РНК (CircRNAs) являются эндогенными, не кодирующих РНК, которые привлекли внимание, учитывая их широкое выражение в эукариотической транскриптоме1,2,3. Они образуются, когда экзоны обратно-сращивания друг к другу и, следовательно, первоначально считались сращивания артефактов4,5. Тем не менее, недавние исследования показали, что циркрнки экспонат авт., ткани, и стадии развития специфической экспрессии3,6 и эволюционно сохранены2,3. Кроме того, они участвуют в посредничестве белково-белковых взаимодействий7,микроРНК (miRNA) связывания3,8,9,10,и регуляции скрушины генов родительских11.
В классическом секвенировании РНК (РНК-сек) циркрнки могут быть полностью потеряны при строительстве библиотеки в результате выбора поли-А для мРНК или могут быть трудно изолировать, учитывая их низкое изобилие. Тем не менее, последние исследования характеристик циркрнки включили предварительный этап лечения с использованием RNase R для того, чтобы обогатить для цирка2,12,13. RNase R является экзорибонуклеазом, который переваривает линейные РНК, оставляя за собой круговые структуры РНК. Протоколы обогащения CircRNA были оптимизированы путем генерации и сравнения данных из двух коммерчески доступных целых комплектов транскриптомной библиотеки, с шагом предварительной обработки RNase R и без него, а также с использованием различных количеств общего объема ввода РНК (от 1 до 4 мкг). Оптимизированный протокол затем использовался для оценки обилия циркрнков в пяти различных областях мозга (мозжечок ,BC), нижняя теметельная доля «IP», средняя височная извилина «Mg», затылочная кора и превосходная лобная извилина »SF» и четыре других типа тканей (liver (ПА) , легочная « LU», лимфальное узели). Библиотеки RNA-seq были сопряжены с последовательностью конца и данные были проанализированы с помощью шести различных алгоритмов прогнозирования циркуляции: find_circ3,CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, и CIRCexplorer18. На основе нашего анализа, наибольшее количество уникальных циркрнков было обнаружено при использовании мель общей РНК комплект подготовки библиотеки с RNase R предварительной обработки и 4 мкг общего ввода РНК. Оптимизированный протокол описан здесь. Как сообщалось ранее19,20, наибольшее обогащение циркрнков наблюдалось в головном мозге по сравнению с другими типами тканей.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Циркулярные РНК (circRNAs) представляют собой класс некодирующих РНК, участвующих в функциях, включая регулирование микроРНК (miRNA), посредничество белково-белковых взаимодействий и регуляцию скррижки генов родителей. В классическом следующем поколении секвенирования РНК (РНК-сек), циркрнки, как правило, упускается из виду в результате выбора поли-A во время строительства библиотек мРНК, или находятся в очень низком изобилии, и поэтому трудно изолировать и обнаружить. Здесь был оптимизирован протокол строительства библиотеки circRNA путем сравнения комплектов подготовки библиотек, вариантов предварительной обработки и различных общих объемов ввода РНК. Были протестированы два коммерчески доступных целых комплекта подготовки библиотеки транскриптома, с и без RNase R предварительной обработки, а также с использованием переменных количеств общего объема РНК-ввода (1 до 4 мкг). Наконец, несколько типов тканей; включая печень, легкие, лимфатические узлы и поджелудочную железу; а также несколько областей мозга; включая мозжечок, нижнюю теменной доли, среднюю височную извилину, затылочную кору и превосходную лобную извилину; были сравнена для оценки изобилия циркрнки по типам тканей. Анализ генерируемых данных РНК-сек с использованием шести различных инструментов обнаружения циркрнки (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC и CIRCexplorer) показал, что полный комплект подготовки библиотеки РНК с RNase R предварительной обработкой и 4 мкг РНК-ввода является оптимальным метод определения наивысшего относительного числа циркрн. В соответствии с предыдущими выводами, наибольшее обогащение циркрнков наблюдалось в тканях мозга по сравнению с другими типами тканей.

Сначала была проведена оценка данных, генерируемых с использованием коммерчески доступной универсальной РНК-системы управления (УК) и с использованием двух комплектов подготовки библиотек, оба из которых включают этап истощения рибо в своих протоколах. Используя аналитический рабоч?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Круговые РНК (циркрнки) являются некодирующие РНК, которые могут иметь роль в транскрипционной регуляции и посредничестве взаимодействий между белками. После оценки различных параметров для строительства библиотек секвенирования циркрнки был составлен протокол с использованием застрявшей общей подготовки библиотеки РНК с помощью предварительной обработки RNase R и представлен здесь.

Идентификация циркулярных РНК с использованием секвенирования РНК

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Этот протокол является результатом оценки ключевых аспектов подготовки библиотеки циркРНК, таких как тип комплекта, обработка RNase R, объемы ввода и их влияние на обнаружение циркРНК. Она обеспечивает оптимальное обнаружение циркРНК и предоставляет данные по регулируемым параметрам в зависимости от потребностей пользователя. Выявление циркРНК в различных типах образцов поможет нам лучше понять распределение их экспрессии и создаст основу для разграничения функциональной роли этих молекул.Этот метод может быть применен к любой общей выборке РНК. Важно хранить образцы РНК на льду до начала протокола. Оцените значения RIN и DV200 на Agilent Bioanalyzer или TapeStation перед подготовкой и следуйте соответствующим процедурам при работе с РНК.Начните с разбавления общей РНК до четырех микрограммов в 39 микролитров воды без RNase и трубопроводов его вверх и вниз, чтобы смешать. В отдельной трубке используйте 1x RNase R Buffer для разбавления RNase R до рабочей концентрации в два единицы на микролитер. Pipette 39 микролитров общей РНК и пять микролитров 10x RNase R Реакция буфера в 1,5-микролитровую реакцию трубки, и перемешать.Добавьте шесть микролитров разбавленного RNase R.Then отрегулируйте пипетки до полного объема реакции и смешайте раствор, трубя вверх и вниз в 10 раз. Поместите трубку в 37-градусную ванну с водой по Цельсию в течение 10 минут, убедившись, что полный объем реакции погружается в водяную баню. Затем поместите трубку на лед, и сразу же приступить к очистке РНК и концентрации.Перед началом, подготовить РНК мыть буфер путем смешивания концентрата с 48 миллилитров 100% этанола, и место очистки колонн в сбор труб. Когда он будет готов, добавьте два тома РНК-связывающего буфера в обработанный RNase R и хорошо перемешайте. Добавьте в смесь 150 микролитров 100% этанола в общей сложности 300 микролитров, перенесите весь объем на колонку и центрифугу на 30 секунд.Удалите поток и добавьте 400 микролитров РНК Prep Buffer непосредственно к столбецу. Центрифуга в течение 30 секунд, и отбросить поток до конца. Затем добавьте 700 микролитров РНК Wash Buffer в столбец, центрифугу в течение 30 секунд и отбросьте поток.Добавьте еще 400 микролитров буфера вымой, центрифуги на две минуты, и перенесите колонку в свежую 1,5-миллилитровую трубку без RNase. Аккуратно добавьте 11 микролитров воды без RNase непосредственно к колонке, удерживая наконечник пипетки прямо над фильтром столбца. Пусть образец сидит в течение одной минуты при комнатной температуре, а затем центрифуга его в течение одной минуты.Убедитесь, что есть поток через в 1,5-миллилитровой трубки, и отбросить столбец. Очищенный образец РНК может храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию или немедленно использоваться для подготовки библиотеки. Передача 10 микролитров очищенной общей РНК в чистую колодец в 96-хорошо ПЦР пластины.Добавьте пять микролитров rRNA Binding Buffer, а затем пять микролитров rRNA Removal Mix, затем аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы смешать реагенты. Печать пластины, и инкубировать его в течение пяти минут при 68 градусов по Цельсию на запрограммированный и разогретый термоциклер блока. После инкубации, пусть пластины сидеть при комнатной температуре в течение одной минуты.Снимите уплотнение с тарелки и добавьте в образец 35 микролитров вихревых бусинок для удаления РНК комнатной температуры. Отрегулируйте пипетки до 45 микролитров, и пипетки вверх и вниз от 10 до 20 раз, чтобы тщательно перемешать. Пусть пластина сидеть при комнатной температуре в течение одной минуты.Перенесите пластину на магнитный стенд и инкубировать ее там в течение одной минуты или до тех пор, пока раствор не прояснится. Перенесите супернатант в новую колодец на тарелке. Затем перенесите пластину с магнитного стенда на стенд пластины.Vortex РНК очистки бисера, пока они хорошо рассеяны, и добавить 99 микролитров бисера в образец. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать, и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 10 минут. Перенесите пластину на магнитный стенд и оставьте ее там на пять минут или до тех пор, пока раствор не прояснит, затем удалите и выбросьте все супернатанты из колодец.С пластиной еще на магнитной подопечной, добавить 200 микролитров свежеприготовленного 80% этанола в колодец, не нарушая бисера. Оставьте этанол в колодец на 30 секунд, затем удалите и отбросьте его. Добавить 11 микролитров Elution Buffer в колодец, и пипетки его вверх и вниз, чтобы смешать.Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух минут, затем передать его обратно на магнитную подсвечение, и держать его там, пока раствор очищается. Перенесите 8,5 микролитров супернатанта в новую колодец на той же пластине и добавьте 8,5 микролитров Elute, Primer, Fragment High Mix к каждой хорошо содержащей образец. Pipette вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать, печать пластины, и инкубировать его в течение восьми минут в термоциклер разогрет до 94 градусов по Цельсию.Охладить образец до четырех градусов по Цельсию, удалить пластину из термоциклера, и центрифуга его кратко. Для этого протокола были оценены два комплекта для подготовки библиотеки - TruSeq и KAPA. В целом, при использовании комплекта TruSeq было обнаружено большее количество циркулярных РНК и более низкий процент рибосомной РНК, поэтому TruSeq был выбран для дальнейших экспериментов.Значение предварительной обработки RNase R оценивалось путем сопоставления данных, полученных из предварительно обработаваемых и необработавающих библиотек. Как и ожидалось, в заранее обработаваемых библиотеках последовательно выявлено большее число циркулярных РНК по сравнению с необработаваемыми. Объем входной РНК был оптимизирован для выявления более высокого разнообразия круговых РНК.Библиотеки были подготовлены с использованием одного, двух и четырех микрограммов входной РНК, и при использовании четырех микрограммов общей РНК наблюдалось наибольшее разнообразие видов круговой РНК. Оптимизированный протокол был использован для сравнения кругового изобилия РНК в пяти областях мозга от четырех здоровых доноров и для других типов тканей от шести здоровых доноров. В целом, более высокое обилие круговой RNase наблюдалось в головном мозге по сравнению с другими типами тканей.Важно помнить, чтобы следовать соответствующим процедурам при работе с РНК, в том числе носить перчатки, тщательно очистки скамейки и пипетки с RNase салфетки или спрей до начала протокола, и сохранение РНК на льду заранее. После этой процедуры может быть выполнена ортогональная проверка, такая как секвенирование Сэнгером выявленных соединений циркРНК. Открытие новых циркРНК и дополнительные доказательства их присутствия вырезает новую область исследований для изучения их биологических функций.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Транскриптомный Анализ<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; Элеганс</em&gt; РНК Секвенирование данных через Tuxedo люкс по проекту Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Метаболические маркировки и профилирование передачи РНК с помощью Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Экспрессирующих длиной некодирующих РНК с помощью активации генов ТРИФОСФАТЫ

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...