Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Vi är tacksamma för banner Sun Health Research Institute hjärna och Body donation program (BBDP) i Sun City, Arizona för tillhandahållande av mänskliga hjärnvävnader. BBDP har fått stöd av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (U24 NS072026 nationella hjärn-och vävnads resurser för Parkinsons sjukdom och relaterade sjukdomar), National Institute on aging (P30AG19610 Arizona Alzheimers sjukdom Core Center), Arizona Department of Health Services (kontrakt 211002, Arizona Alzheimer ' s Research Center), Arizona biomedicinska forsknings kommissionen (kontrakt 4001, 0011, 05-901 och 1001 till Arizona Parkinson ' s disease Consortium) och Michael J. Fox Foundation för Parkinsons forskning27. Denna studie stöddes också av DHS och delstaten Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). Vi tackar också Andrea Schmitt (banner Research) och Cynthia lechuga (TGen) för administrativt stöd.

Denna forskning har utförts i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd. Hjärnvävnader erhölls från banner Sun Health Research Institute hjärna och kropp donation program i Sun City, AZ. Verksamheten i hjärnan och kroppen donation programmet är godkända av den västerländska institutionella Granskningsnämnden (WIRB Protocol #20120821). Alla försökspersoner eller deras juridiska ombud undertecknade informerat samtycke. Kommersiella (icke-hjärna) bio...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).</li><li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

I denna studie testades två kommersiellt tillgängliga biblioteks berednings satser, förbehandlings alternativ och indata-RNA-belopp för att optimera ett circRNA anriknings protokoll för byggande av circRNA sekvenserings bibliotek. Baserat på denna studie bedömningar, ett antal viktiga aspekter och kritiska steg för att skapa circRNA sekvensering bibliotek är uppenbara. Vår utvärdering bekräftar nyttan av RNase R pre-behandling, vilket återspeglas av det ökade antalet circRNAs upptäcks. Sammantaget observer...

Cirkulär rnas (circrnas) är endogena, icke-kodning rnas som har fått uppmärksamhet med tanke på deras genomträngande uttryck i eukaryota transkriptome1,2,3. De bildas när exonerna back-splice till varandra och därmed ansågs inledningsvis vara splitsning artefakter4,5. Nyligen genomförda studier har dock visat att circrnas uppvisar celltyp, vävnad och utvecklingsstadiet specifikt uttryck3,6 och är evolutionärt bevarad2,3. Dessutom är de inblandade i medling av protein-protein interaktioner7, Micro-RNA (Mirna) bindning3,8,9,10, och reglering av föräldra Gene transkription11.
I klassisk RNA-sekvensering (RNA-SEQ) kan circRNAs helt försvinna under biblioteks konstruktionen till följd av poly-A-val för mRNA eller kan vara svårt att isolera med tanke på deras låga förekomst. De senaste circrna karakteriseringsstudierna har dock införlivat ett steg före behandling med RNase R för att berika circrnas2,12,13. RNase R är en exoribonuclease som smälter linjär rnas, lämnar bakom cirkulära RNA strukturer. CircRNA anrikning protokoll optimerades genom att generera och jämföra data från två kommersiellt tillgängliga hela transkriptome bibliotek byggsatser, med och utan en RNase R före behandling steg, och med varierande mängder av totala RNA-ingång (1 till 4 μg). Det optimerade protokollet användes sedan för att utvärdera förekomsten av circRNAs i fem olika hjärnregioner (cerebellum [BC], sämre parietallob [IP], mellersta tidsmässiga gyrus [MG], occipital cortex [OC] och överlägsen frontal gyrus [SF]) och fyra andra vävnadstyper (lever [LV], lung [LU], lymfkörtel [LN] och bukspottkörteln [PA]). RNA-SEQ-biblioteken var Parade end sekvenserade och data analyserades med hjälp av sex olika algoritmer circrna förutsägelse: find_circ3, Ciri14, mapsplice15, kniv16, DCC17, och circexplorer18. Baserat på vår analys upptäcktes det högsta antalet unika circRNAs vid användning av en icke-återvinningsbara total RNA-biblioteksberedning med RNase R pre-Treatment och 4 μg totalt ingångrna. Det optimerade protokollet beskrivs här. Som tidigare rapporterats19,20observerades den högsta anrikningen av circrnas i hjärnan jämfört med andra vävnadstyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Cirkulär RNAs (circRNAs) är en klass av icke-kodning RNAs inblandade i funktioner inklusive mikro-RNA (miRNA) reglering, medling av protein-protein interaktioner, och reglering av föräldrarnas gentranskription. I klassisk nästa generations RNA-sekvensering (RNA-SEQ) förbises circRNAs vanligtvis som ett resultat av poly-A-val under byggandet av mRNA-bibliotek, eller finns i mycket låg förekomst, och är därför svåra att isolera och upptäcka. Här, en circRNA bibliotek konstruktions protokoll optimerades genom att jämföra bibliotek förberedelse kit, pre-behandling alternativ och olika totala RNA ingångsbelopp. Två kommersiellt tillgängliga hela transkriptome bibliotek förberedelse kit, med och utan RNase R förbehandling, och med hjälp av varierande mängder av totala RNA-ingången (1 till 4 μg), testades. Slutligen, flera vävnadstyper; inklusive lever, lungor, lymfkörtel, och bukspottkörteln; och flera hjärnregioner; inklusive lillhjärnan, sämre parietallob, mellersta tidsmässiga gyrus, occipital cortex, och överlägsen frontal gyrus; jämfört med att utvärdera circRNA-överflöd över vävnadstyper. Analys av den genererade RNA-SEQ data med hjälp av sex olika circRNA detekterings verktyg (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, och CIRCexplorer) visade att en icke-återvinningsbara totalt RNA bibliotek förberedelse kit med RNase R pre-behandling och 4 μg RNA-ingång är den optimala metod för att identifiera det högsta relativa antalet circRNAs. I överensstämmelse med tidigare fynd observerades den högsta anrikningen av circRNAs i hjärnvävnader jämfört med andra vävnadstyper.

Data som genereras med hjälp av en kommersiellt tillgänglig Universal Control RNA (UC) och med hjälp av två bibliotek berednings satser, som båda inkluderar en ribo-utarmning steg i sina protokoll, bedömdes först. Med hjälp av ett analytiskt arbetsflöde (data analys arbetsflöde, avsnitt 4) upptäcktes ett större antal circRNAs i TruSeq-datauppsättningarna jämfört med kapa Ones (figur 1). Även om de ribosomala RNA (rRNA) procenten låg under 5% i datauppsättningar från båda ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Cirkulär RNAs (circRNAs) är icke-kodande RNAs som kan ha roller i transkriptionell reglering och förmedla interaktioner mellan proteiner. Efter bedömning av olika parametrar för byggandet av circRNA sekvenserings bibliotek, ett protokoll sammanställdes utnyttjar Stranded totalt RNA Library beredning med RNase R pre-behandling och presenteras här.

Identifiering av cirkulär RNAs med RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Detta protokoll är resultatet av utvärdering av viktiga aspekter av CircRNA bibliotek förberedelse, såsom kit typ, RNase R behandling, ingående mängder och deras inverkan på circRNA upptäckt. Den möjliggör optimal circRNA-detektering och ger data om justerbara parametrar beroende på användarens behov. Identifiera circRNAs i olika provtyper kommer att hjälpa oss att bättre förstå fördelningen av deras uttryck och sätter scenen för delineating den funktionella roll dessa molekyler.Denna metod kan tillämpas på alla totala RNA-prov. Det är viktigt att hålla RNA-prover på is innan protokollet påbörjas. Bedöm RIN- och DV200-värdena på Agilent Bioanalyzer eller TapeStation före prep, och följ lämpliga procedurer när du arbetar med RNA.Börja med att späda ut totalt RNA till fyra mikrogram i 39 mikroliter RNase-fritt vatten och pipettering upp och ner för att blanda. I ett separat rör, använd 1x RNase R Buffert för att späda ut RNase R till en arbetskoncentration på två enheter per mikroliter. Pipett 39 mikroliter av totalt RNA och fem mikroliter av 10x RNase R Reaction Buffer till en 1,5-mikroliter reaktionsrör, och blanda.Tillsätt sex mikroliter av den utspädda RNase R.Justera sedan pipetten till full reaktionsvolym, och blanda lösningen genom pipettering upp och ner 10 gånger. Placera röret i ett 37-graders Celsius vattenbad i 10 minuter, se till att den fulla reaktionsvolymen sänks ned i vattenbadet. Sedan, placera röret på is, och omedelbart fortsätta med RNA sanering och koncentration.Före start, förbereda RNA Wash Buffer genom att blanda koncentratet med 48 milliliter 100%etanol, och placera reningskolumner i uppsamlingsrör. När du är klar, lägg till två volymer av RNA-bindningsbuffert till RNase R-behandlade provet, och blanda väl. Tillsätt 150 mikroliter av 100%etanol till blandningen för totalt 300 mikroliter, överför hela volymen till kolonnen, och centrifug i 30 sekunder.Ta bort flödet genom, och lägga till 400 mikroliter av RNA Prep Buffer direkt till kolumnen. Centrifugera i 30 sekunder, och kasta flödet igenom. Lägg sedan till 700 mikroliter RNA-tvättbuffert i kolonnen, centrifugera i 30 sekunder och kasta flödet igenom.Tillsätt ytterligare 400 mikroliter av Tvättbufferten, centrifug i två minuter, och överför kolonnen till ett färskt RNase-fritt 1,5-milliliterrör. Tillsätt försiktigt 11 mikroliter RNase-fritt vatten direkt i kolonnen genom att hålla pipettspetsen precis ovanför kolonnfiltret. Låt provet sitta i en minut i rumstemperatur, och sedan centrifug det i en minut.Se till att det flödar igenom i 1,5-milliliterröret och kassera kolonnen. Det renade RNA-provet kan förvaras vid minus 80 grader Celsius eller användas omedelbart för biblioteksberedning. Överför 10 mikroliter av det renade totala RNA till en ren brunn i en 96-väl PCR-platta.Tillsätt fem mikroliter av rRNA Binding Buffer följt av fem mikroliter av rRNA Removal Mix, sedan försiktigt pipetter upp och ner för att blanda reagenserna. Försegla plattan, och inkubera den i fem minuter vid 68 grader Celsius på en förprogrammerad och förvärmd termocykler block. Efter inkubationen, låt plattan sitta i rumstemperatur i en minut.Ta bort tätningen från plattan, och tillsätt 35 mikroliter av virvelad rumstemperatur rRNA borttagning pärlor till provet. Justera pipetten till 45 mikroliter, och pipetten uppåt och nedåt 10 till 20 gånger för att blanda ordentligt. Låt plattan sitta i rumstemperatur i en minut.Överför plattan till ett magnetiskt stativ, och inkubera den där i en minut eller tills lösningen klarnat. Överför supernatanten till ny brunn på plattan. Överför sedan plattan från magnetstativ till plåtstativ.Vortex RNA sanering pärlor tills de är väl spridda, och lägga till 99 mikroliter av pärlor till provet. Pipett upp och ner för att blanda, och inkubera plattan i rumstemperatur i 10 minuter. Överför plattan till magnetstativ, och lämna den där i fem minuter eller tills lösningen klarnat, ta sedan bort och kassera all supernatant från brunnen.Med plattan fortfarande på magnetstativ, tillsätt 200 mikroliter av nyberedda 80%etanol till brunnen utan att störa pärlorna. Låt etanolen vara kvar i brunnen i 30 sekunder, ta sedan bort och kassera den. Tillsätt 11 mikroliter Elution Buffer till brunnen, och pipettera den upp och ner för att blanda.Inkubera plattan i rumstemperatur i två minuter, överför den sedan tillbaka till magnetstativ, och håll den där tills lösningen klarnat. Överför 8,5 mikroliter av supernatanten till en ny brunn på samma platta, och tillsätt 8,5 mikroliter av Elute, Primer, Fragment High Mix till varje brunn som innehåller ett prov. Pipett upp och ner 10 gånger för att blanda noggrant, försegla plattan, och inkubera den i åtta minuter i en termocyklare förvärmt till 94 grader Celsius.Kyl provet till fyra grader Celsius, ta bort plattan från termocyklaren och centrifugera det kort. Två byggsatser för bibliotek, TruSeq och KAPA, bedömdes för detta protokoll. Totalt sett upptäcktes ett högre antal cirkulära RNAs och lägre andel ribosomalt RNA när du använder TruSeq-satsen, så TruSeq valdes ut för ytterligare experiment.Betydelsen av RNase R förbehandling utvärderades genom att jämföra de data som genereras från förbehandlade och icke-prebehandlade bibliotek. Som väntat identifierades ett högre antal cirkulära RNAs konsekvent i de förbehandlade biblioteken jämfört med icke-förbehandlade. Mängden inmatnings-RNA optimerades för att upptäcka en högre mångfald av cirkulära RNAs.Biblioteken förbereddes med hjälp av ett, två och fyra mikrogram inmatnings-RNA, och den högsta mångfalden av cirkulära RNA-arter observerades när man använde fyra mikrogram totalt RNA. Det optimerade protokollet användes för att jämföra cirkulära RNA-överflöd i fem hjärnregioner från fyra friska donatorer och för andra vävnadstyper från sex friska donatorer. Sammantaget observerades ett högre överflöd av cirkulär rNase i hjärnan jämfört med andra vävnadstyper.Det är viktigt att komma ihåg att följa lämpliga förfaranden när du arbetar med RNA, inklusive att bära handskar, noggrant rengöra bänken och pipetter med RNase våtservetter eller spray innan du påbörjar protokollet, och hålla RNA på is i förväg. Efter denna procedur kan ortogonal validering såsom Sanger sekvensering av identifierade circRNA-korsningar utföras. Upptäckten av nya circRNAs och ytterligare bevis på deras närvaro skär ut ett nytt forskningsområde för att utforska sina biologiska funktioner.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analys av<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing data via Tuxedo Suite på Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifika och selektiv erkännande av dubbelsträngat RNA över enkelsträngat RNA av kemiskt modifierade peptid nukleinsyror

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliska märkning och profilering av överföring RNAs använder Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Överuttryck av långa icke-kodande RNAs med gen-aktiverande CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA från helblod med Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...