Name: identification of circular rnas using rna sequencing
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Biz Banner Güneş Sağlık Araştırma Enstitüsü Beyin ve Vücut Bağışı Programı (BBDP) Sun City, Arizona insan beyin dokularının sağlanması için müteşekkiriz. BBDP Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (U24 NS072026 Parkinson Hastalığı ve İlişkili Bozukluklar için Ulusal Beyin ve Doku Kaynağı), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (P30AG19610 Arizona Alzheimer Hastalığı Çekirdek Merkezi), Arizona Sağlık Hizmetleri Bölümü (sözleşme 211002, Arizona Alzheimer Araştırma Merkezi), Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (sözleşmeler 4001, 0011, 05-901 ve 1001 Arizona Parkinson Hastalığı Konsorsiyumu için) ve Michael J. Parkinson Araştırma Fox Vakfı27. Bu çalışma aynı zamanda DHS ve Arizona Eyaleti (ADHS hibe # ADHS14-052688) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Andrea Schmitt (Banner Araştırma) ve Cynthia Lechuga (TGen) idari destek için teşekkür ederiz.

Bu araştırma, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Beyin dokuları Sun City, AZ Banner Güneş Sağlık Araştırma Enstitüsü Beyin ve Vücut Bağışı Programı elde edildi. Beyin ve Vücut Bağışı Programı'nın faaliyetleri Western Kurumsal İnceleme Kurulu (WIRB protokolü #20120821) tarafından onaylanmıştır. Tüm konular veya yasal temsilcileri bilgilendirilmiş onayı imzaladı. Ticari (beyin dışı) biyonumuneler Proteogenex'ten sat...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733 (2012).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency.">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li><li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures.">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li><li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambled+exons.">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).</li><li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses.">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li><li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis.">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA.">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart.">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li><li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma.">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919 (2016).</li><li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRI:+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification.">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MapSplice:+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery.">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).</li><li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development.">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).</li><li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data.">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant,+conserved,+and+dynamically+expressed.">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li><li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals.">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li><li>Hansen, T. B., Ven&#248;, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools.">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).</li><li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools.">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).</li><li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACValidator:+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs.">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation.">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li><li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circular+RNAs:+bioinformatic+and+experimental+challenges.">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li><li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification.">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).</li><li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program.">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li></ol>

Bu çalışmada, circRNA sıralama kitaplıklarının inşası için circRNA zenginleştirme protokolünü optimize etmek amacıyla ticari olarak kullanılabilen iki kütüphane hazırlama kitleri, ön işlem seçenekleri ve giriş RNA miktarları test edilmiştir. Bu çalışmanın değerlendirmelerine dayanarak, circRNA sıralama kitaplıklarının oluşturulmasında önemli ve kritik adımlar ortaya çıkmıştır. Değerlendirmemiz, tespit edilen circRNA sayısının artmasıyla yansıtTığı üzere RNase R ön arı...

Dairesel RNA'lar (CircRNA'lar) ökaryotik transkripsiyon1,2,3'teyaygın olarak ifade edilen endojen, kodlamayan RNA'lardır. Onlar exons birbirlerine geri-splice oluşur ve bu nedenle başlangıçta eserler4,5birleştirme olarak kabul edildi . Ancak, son çalışmalar, circRNA'ların hücre tipini, dokuyu ve gelişim evresine özgü ekspresyonu3,6 ve evrimsel olarak korunmuş2,3olduğunu göstermiştir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri arabuluculuk yer almaktadır7, mikro-RNA (miRNA) bağlayıcı3,8,9,10, ve ebeveyn gen transkripsiyon11düzenlenmesi .
Klasik RNA diziliminde (RNA-seq), circRNA'lar mRNA'lar için poli-A seçimi sonucunda kütüphane inşaatı sırasında tamamen kaybolabilir veya düşük bollukları göz önüne alındığında izole edilmesi zor olabilir. Ancak, son circRNA karakterizasyon çalışmaları amacıyla circRNA2,12,13için zenginleştirmek için RNase R kullanarak bir ön tedavi adımı dahil var. RNase R, dairesel RNA yapılarını geride bırakarak lineer RNA'ları sindiren bir exoribonuclease'dir. CircRNA zenginleştirme protokolleri, rnase R ön işlem adımı olan ve olmayan iki ticari olarak kullanılabilen tüm transkripsiyon kitaplığı yapı kitlerinden elde edilen verilerin üretilmesi ve karşılaştırılması ve değişen miktarlarda toplam RNA girişi kullanılarak optimize edilmiştir (1 ila 4 g). Optimize edilmiş protokol daha sonra beş farklı beyin bölgesinde (beyincik [BC], inferior parietal lob [IP], orta temporal girus [MG], oksipital korteks [OC] ve üstün frontal girus [SF]) ve diğer dört doku tipi (karaciğer [LV], akciğer [LU], lenf nodu [LN] ve pankreas [PA]) arasında circRNA bolluğunu değerlendirmek için kullanıldı. RNA-seq kütüphaneleri sıralı olarak eşleştirilmiş ve veriler altı farklı circRNA tahmin algoritmaları kullanılarak analiz edildi: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, ve CIRCexplorer18. Analizlerimize göre, RNase R ön işlem ve 4 μg toplam giriş RNA ile mahsur toplam RNA kütüphane hazırlama kiti kullanılarak en yüksek sayıda benzersiz circNA tespit edilmiştir. Optimize edilmiş protokol burada açıklanmıştır. Daha önce bildirildiği gibi19,20, circRNA en yüksek zenginleştirme diğer doku tipleri ile karşılaştırıldığında beyinde gözlendi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GP-L1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>SR L 200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (foil covers)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Accessories (tips)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Film for Microplates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads 450 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>951020401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-410-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-410-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-402-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-402-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Total RNA Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA cleanup and concentrator - 5</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>RCC-100</td>
			<td>Contains purification columns, collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td></td>
			<td>RNA Cleanup beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td>
			<td>ThermoFisher (LifeTech)</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Nucleic Acid analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TElowE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020596</td>
			<td>Kit used in section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Compartment Divided Tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Supply Center by Thermo Fischer</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal control RNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>740000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of circular rnas using rna sequencing

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), mikro-RNA (miRNA) düzenlemesi, protein-protein etkileşimlerinin arabuluculuğu ve ebeveyn gen transkripsiyonunun düzenlenmesi gibi işlevlerde yer alan kodlamayan RNA'lar sınıfıdır. Klasik yeni nesil RNA sıralamasında (RNA-seq), circRNA'lar genellikle mRNA kitaplıklarının inşası sırasında poli-A seçiminin bir sonucu olarak gözden kaçırılır veya çok düşük bollukta bulunur ve bu nedenle izole etmek ve tespit etmek zordur. Burada, bir circRNA kütüphane inşaat protokolü kütüphane hazırlama kitleri, ön işlem seçenekleri ve çeşitli toplam RNA giriş miktarları karşılaştırılarak optimize edildi. RNase R ön işlem li ve olmayan ve değişken miktarda toplam RNA girişi (1 ila 4 g) kullanılarak, ticari olarak kullanılabilen iki tam transkripsiyon kitaplığı hazırlama kitleri test edildi. Son olarak, birden fazla doku tipleri; karaciğer, akciğer, lenf düğümü ve pankreas dahil; yanı sıra birden fazla beyin bölgeleri; beyincik dahil, inferior parietal lob, orta temporal girus, oksipital korteks, ve üstün frontal girus; doku tipleri arasında circRNA bolluğunu değerlendirmek için karşılaştırıldı. Altı farklı circRNA algılama aracı (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC ve CIRCexplorer) kullanılarak oluşturulan RNA-seq verilerinin analizi, RNase R ön işlem ve 4 μg RNA girişi ile mahsur toplam RNA kitaplık hazırlama kitinin en uygun olduğunu ortaya koymuştur. circRNA'ların en yüksek göreli sayısını belirleme yöntemi. Önceki bulgularla tutarlı olarak, beyin dokularında diğer doku tiplerine göre en yüksek circRNA zenginleştirme gözlendi.

Ticari olarak kullanılabilen evrensel kontrol RNA (UC) kullanılarak ve her ikisi de protokollerinde ribo-tükenme adımı içeren iki kitaplık hazırlama kitleri kullanılarak oluşturulan veriler ilk olarak değerlendirildi. Truseq veri kümelerinde Kapa veri kümelerine göre daha yüksek sayıda circRNA saptandı (Veri analizi iş akışı, bölüm 4), genel olarak (Şekil 1). Ribozomal RNA (rRNA) yüzdeleri daha düşük giriş miktarları için her iki kitten (1, 2 ug) veri kümeleri...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing at JoVE.com

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Bu protokol, kit tipi, RNase R tedavisi, giriş miktarları ve bunların circRNA tespiti üzerindeki etkileri gibi circRNA kitaplık hazırlamanın temel yönlerini değerlendirmenin bir sonucudur. En iyi circRNA algılamasını sağlar ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak ayarlanabilir parametreler hakkında veri sağlar. Farklı örnek türlerinde circRNA'ların belirlenmesi, ifadelerinin dağılımını daha iyi anlamamıza yardımcı olacak ve bu moleküllerin işlevsel rolünün belirlenmesine zemin hazırlar.Bu yöntem herhangi bir toplam RNA örneğine uygulanabilir. Protokolbaşlamadan önce RNA örneklerini buzda tutmak önemlidir. Hazırlıktan önce Agilent Bioanalyzer veya TapeStation'daki RIN ve DV200 değerlerini değerlendirin ve RNA ile çalışırken uygun prosedürleri uygulayın.Toplam RNA'yı 39 mikrolitre RNase içermeyen suda dört mikrograma seyrelterek ve karıştırmak için yukarı ve aşağı borulandırarak başlayın. Ayrı bir tüpte, RNase R'yi mikrolitre başına iki birimlik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltmek için 1x RNase R Tampon kullanın. Pipet 39 mikrolitre toplam RNA ve 10x RNase R Reaksiyon Tampon beş mikrolitre 1.5-mikrolitre reaksiyon tüpü içine, ve karıştırın.Seyreltilmiş RNase R.Then tam reaksiyon hacmine pipet ayarlamak ve 10 kez yukarı ve aşağı boru lama tarafından çözelti karıştırın altı mikrolitre ekleyin. Tüpü 37 derecelik bir su banyosuna 10 dakika yerleştirin ve tam reaksiyon hacminin su banyosuna daldırDığından emin olun. Sonra, buz üzerinde tüp yerleştirin ve hemen RNA temizleme ve konsantrasyon ile devam edin.Başlamadan önce, konsantreyi %100 etanolün 48 mililitresi ile karıştırarak RNA Yıkama Tamponu'nu hazırlayın ve arınma kolonlarını toplama tüplerine yerleştirin. Hazır olduğunuzda, RNaR işlem görmüş örneğe iki cilt RNA Bağlama Arabelleği ekleyin ve iyice karıştırın. Toplam 300 mikrolitre karışıma 150 mikrolitre %100 etanol ekleyin, tüm hacmi kolona aktarın ve 30 saniye santrifüj yapın.Akışı kaldırın ve doğrudan sütuna 400 mikrolitre RNA Hazırlık Arabelleği ekleyin. 30 saniye santrifüj ve akışı atın. Ardından, sütuna 700 mikrolitre RNA Yıkama Tamponu ekleyin, 30 saniye santrifüj yapın ve akışı atın.Yıkama Tamponbaşka 400 mikrolitre ekleyin, iki dakika için santrifüj, ve taze bir RNase-free 1.5 mililitre tüp sütun aktarın. Pipet ucunu kolon filtresinin hemen üzerinde tutarak doğrudan kolona 11 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin. Örnek oda sıcaklığında bir dakika oturup, ve sonra bir dakika için santrifüj edelim.1,5 mililitrelik tüpte akış olduğundan emin olun ve sütunu atın. Saflaştırılmış RNA örneği eksi 80 derecede saklanabilir veya kütüphane hazırlığı için hemen kullanılabilir. Saflaştırılmış toplam RNA'nın 10 mikrolitresini 96 kuyulu bir PCR plakalı temiz bir kuyuya aktarın.RRNA Bağlama Tampon beş mikrolitre ekleyin ve rRNA Kaldırma Mix beş mikrolitre ardından, sonra yavaşça pipet yukarı ve aşağı reaktifleri karıştırmak için. Plakayı kapatın ve önceden programlanmış ve önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda 68 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, plaka bir dakika oda sıcaklığında oturalım.Mührü plakadan çıkarın ve numuneye 35 mikrolitre girdaplı oda sıcaklığında rRNA kaldırma boncukları ekleyin. Pipeti 45 mikrolitreye, pipetleri de iyice karıştırmak için 10 ila 20 kez yukarı ve aşağı ayarlayın. Plaka bir dakika oda sıcaklığında oturalım.Plakayı manyetik bir standa aktarın ve bir dakika veya çözelti temize çıkana kadar orada kuluçkaya yatırın. Supernatant'ı plakadaki yeni kuyuya aktarın. Daha sonra plakayı manyetik standdan plaka standına aktarın.Vortex RNA iyi dağılmış kadar boncuk temizleme ve örnek için boncuk 99 mikrolitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tabak kuluçka. Plakayı manyetik standa aktarın ve beş dakika veya çözelti temize çıkana kadar orada bırakın, sonra tüm supernatant'ı kuyudan çıkarın ve atın.Plaka hala manyetik stand üzerinde yken, boncukları bozmadan kuyuya 200 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. 30 saniye boyunca kuyuda etanol bırakın, sonra çıkarın ve atın. Kuyuya 11 mikrolitre Elütion Tampon ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet.Plakayı oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın, sonra manyetik standa geri aktarın ve çözelti temize çıkana kadar orada tutun. Süpernatantın 8,5 mikrolitresini aynı plakaüzerindeki yeni bir kuyuya aktarın ve numune içeren her kuyuya 8,5 mikrolitre Elute, Primer, Fragment High Mix ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için, plaka mühür ve 94 santigrat derece önceden ısıtılmış bir termocycler sekiz dakika kuluçka.Numuneyi dört dereceye kadar soğutun, plakayı termocycler'dan çıkarın ve kısa bir süre santrifüj edin. Bu protokol için TruSeq ve KAPA olmak üzere iki kütüphane hazırlama kitleri değerlendirildi. Genel olarak, TruSeq kiti ni kullanırken daha yüksek sayıda dairesel RNA ve daha düşük ribozomal RNA yüzdesi saptandı, bu yüzden daha fazla deney için TruSeq seçildi.RNase R ön tedavisinin önemi, önceden tedavi edilmiş ve tedavi edilmeyen kütüphanelerden elde edilen veriler karşılaştırılarak değerlendirildi. Beklendiği gibi, önceden tedavi edilmeyen kütüphanelere kıyasla, daha yüksek sayıda dairesel RNA tutarlı bir şekilde önceden tedavi edilmemiş kütüphanelerde tanımlanmıştır. Giriş RNA miktarı dairesel RNA'ların daha yüksek bir çeşitliliğini tespit etmek için optimize edildi.Kütüphaneler bir, iki ve dört mikrogram giriş RNA kullanılarak hazırlandı ve dört mikrogram toplam RNA kullanırken dairesel RNA türlerinin en yüksek çeşitliliği gözlendi. Optimize edilmiş protokol, dört sağlıklı donörden beş beyin bölgesinde ve altı sağlıklı donörün diğer doku tipleri için dairesel RNA bolluklarını karşılaştırmak için kullanılmıştır. Genel olarak, dairesel RNase daha yüksek bir bolluk diğer doku tiplerine göre beyinde gözlendi.RNA ile çalışırken eldiven takmak, protokole başlamadan önce tezgah ve pipetleri RNase mendilleriyle veya spreyle iyice temizlemek ve RNA'yı önceden buzda tutmak da dahil olmak üzere uygun prosedürleri izlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, tanımlanan circRNA kavşaklarının Sanger sıralanması gibi ortogonal doğrulama yapılabilir. Yeni circRNA'ların keşfi ve onların varlığına dair daha fazla kanıt, biyolojik işlevlerini keşfetmek için yeni bir araştırma alanı ortaya çıkarıyor.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

arasında Transkriptomik Analizi<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</emGalaxy Projesi Smokin Suite sayesinde&gt; RNA Sıralama Veri

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...