Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

نشكر مركز نورث ويسترن للتنظير المجهري المتقدم على استخدام مجهر نيكون A1 البؤري ومساعدتهم في تخطيط وتحليل التجارب. وقد تم دعم هذا البحث من قبل NIGMS (T32GM008061) (A. M.), وNIA (R00AG041225) ومنحة الباحث الشباب NARSAD من مؤسسة بحوث الدماغ والسلوك (#24133) (A. S. -C.).

وقامت لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نورث وسترن (البروتوكول #IS00001151) باستعراض الأعمال المتعلقة بإعداد ثقافة فرس النهر الأولية والموافقة عليها.
1. التحضير قبل وضع العلامات
<ol><li>
إعداد وصيانة الثقافات الرئيسية لفرس النهر
	<ol>
<li>إعداد الثقافات فرس النهر الأو...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+(NMDA)+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+(AMPA)+Receptors+by+Posttranslational+Modifications.">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons.">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition:+Many+Regulators,+Many+Consequences.">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation.">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient.">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li><li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).</li></ol>

التفاعل بين الخلية وبيئتها (على سبيل المثال، التواصل مع الخلايا الأخرى، والاستجابة لمحفزات مختلفة، وما إلى ذلك)، يعتمد بشكل كبير على التعبير الصحيح للمستقبلات على سطح الخلية. التنظيم السريع والدقيق في محتوى المستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح يتيح الاستجابة الخلوية المناسبة لبيئ...

الخلايا الاستفادة من العملية النشطة للاتجار لتعبئة البروتينات لتوطين تحت الخلية محددة وممارسة صارمة spatiotemporal التنظيم على وظيفتها1. هذه العملية مهمة بشكل خاص لمستقبلات عبر الغشاء، كما الاستجابات الخلوية لمختلف المحفزات البيئية تعتمد على السلاسل التعاقبية داخل الخلايا الناجمة عن تنشيط مستقبلات. الخلايا قادرة على تعديل هذه الاستجابات عن طريق تغيير الكثافة، والتوطين، وتكوين الوحدة الفرعية من المستقبلات المعبر عنها على سطح الخلية عن طريق مستقبلات تحت الخلية تنظيم الاتجار2. إدراج مستقبلات مُدمجة حديثاً في غشاء البلازما، جنباً إلى جنب مع بطانة الرحم وإعادة تدوير المستقبلات الموجودة هي أمثلة على عمليات الاتجار التي تحدد المجموعة الصافية من المستقبلات التي يعبر عنها السطح2. العديد من الآليات الجزيئية تتعاون لتنظيم الاتجار بالبروتين، بما في ذلك تفاعلات البروتين البروتين والتعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفورية، أو التعليب، أو palmitoylation2.
إن تنظيم الاتجار بالمستقبلات مطلوب بشكل خاص في الخلايا المستقطبة بشدة ذات الهياكل المتخصصة للغاية. المثال النموذجي هو السيطرة على وظيفة الخلايا العصبية عن طريق تنظيم الاتجار بمستقبلات الغلوتامات (GluRs)3،4. الجلوتامات، الناقل العصبي المحفز الرئيسي، يربط وينشط الغلورس التي يعبر عنها السطح للسيطرة على الوظائف العصبية الفسيولوجية الأساسية مثل انتقال الأعصاب متشابك واللدونة متشابك. حقيقة أن تغيير الاتجار GluR لوحظ في مجموعة واسعة من الاعتلالات العصبية، بدءا من اضطرابات النمو العصبي إلى الأمراض العصبية التنكسية، يسلط الضوء على أهمية هذه العملية5. وبالتالي، فإن فهم الأحداث الجزيئية التي تتحكم في الاتجار بجلوآر هو أمر ذو أهمية في العديد من مجالات البحث.
في هذا البروتوكول، يتم استخدام طريقة تعتمد على تغذية الأجسام المضادة لتحديد مستوى الغلورس التي يتم التعبير عنها على السطح في الخلايا العصبية الرئيسية لفرس النهر، فضلاً عن تقييم كيفية تؤدي التغيرات في الاستيعاب وإعادة التدوير إلى التعبير الصافي للسطح الملاحظ. استخدام الصيدلة و / أو التعبير المفرط من المستقبلات الخارجية التي تأوي طفرات محددة يجعل هذا البروتوكول نهجا قويا بشكل خاص لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء التكيف الخلايا العصبية لمختلف المحفزات البيئية. ومن الأمثلة النهائية على فائدة هذا البروتوكول دراسة كيفية تأثير التغيرات المتعددة العوامل في البيئة (كما هو الحال في نماذج المرض) على الاتجار بجلوآر من خلال فحص التعبير السطحي في هذه النماذج.
باستخدام أمثلة محددة، يتم إثبات في البداية كيف أن التلاعب الدوائي الذي يحاكي التحفيز الفسيولوجي متشابك [LTP الكيميائية (cLTP)] يزيد من التعبير السطحي للوحدة الفرعية GluA1 الذاتية من نوع AMPA من GluRs (AMPARs) 6- ويجري أيضا تحليل الاتجار بشكل فوسفي - mimetic مبالغ فيه من الوحدة الفرعية GluN2B من نوع الغلورس NMDA (NMDARs) لتجسيد كيفية استخدام هذا البروتوكول لدراسة تنظيم الاتجار بجلوران اتّصالا ً بمرحلة ما بعد الترجمة التعديلات. على الرغم من أن هذه الأمثلة المحددة تستخدم، يمكن بسهولة تطبيق هذا البروتوكول على GluRs الأخرى وغيرها من المستقبلات والبروتينات التي تمتلك مجالات خارج الخلية المضادة للجينات. في حالة عدم وجود أجسام مضادة متاحة للمجالات خارج الخلية، يمكن أن تساعد البروتينات في وضع العلامات على البروتين في وضع العلامات على الأيض خارج الخلية (على سبيل المثال، العلم، Myc-، GFP-agged، إلخ).
ويوفر البروتوكول الحالي تعليمات لتحديد الكثافة الفرعية المحددة للغلور والاتجار بها باستخدام أجسام مضادة محددة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة 1) مجموع التعبير السطحي GluR، 2) استيعاب GluR، و 3) إعادة تدوير GluR. ولدراسة كل عملية على حدة، يُنصح بالبدء بالقسمين 1 و2 ومواصلة العمل إما في القسم 3 أو 4 أو 5. في جميع الحالات، الانتهاء معالقسمين 6 و 8 (الشكل 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

الاستجابات الخلوية للمحفزات الخارجية تعتمد بشكل كبير على مجموعة من المستقبلات التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية في لحظة معينة. وبناء على ذلك، فإن عدد المستقبلات التي يعبر عنها السطح يتكيف باستمرار ويخضع لآليات صارمة للتنظيم. المثال النموذجي واحد من أحداث الاتجار الأكثر دراسة في علم الأحياء هو السيطرة المنظمة للتعبير متشابك من مستقبلات الغلوتامات (غلورس). تتوسط GluRs الغالبية العظمى من انتقال الأعصاب المحفزة في الجهاز العصبي المركزي والسيطرة على التغيرات الوظيفية والهيكلية التي تعتمد على النشاط الفسيولوجي على مستويات متشابك والخلايا العصبية (على سبيل المثال، اللدونة متشابك). التعديلات في عدد, موقع, وتكوين الوحدة الفرعية من السطح أعرب GluRs تؤثر بعمق على وظيفة الخلايا العصبية، وفي الواقع, ترتبط التعديلات في هذه العوامل مع اعتلال اتّصالات عصبيّة مختلفة. المعروضة هنا هي طريقة لدراسة الاتجار GluR في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر المنفصلة. يتم استخدام نهج "تغذية الأجسام المضادة" لتصور بشكل تفاضلي مجموعات غلور المعبر عنها في السطح والأغشية الداخلية. من خلال وضع علامات على مستقبلات السطح على الخلايا الحية وإصلاحها في أوقات مختلفة للسماح لمستقبلات بطانة الرحم و / أو إعادة التدوير، يمكن تقييم عمليات الاتجار هذه ودراستها بشكل انتقائي. هذا هو بروتوكول تنوعا التي يمكن استخدامها في تركيبة مع النهج الدوائية أو الإفراط في التعبير عن المستقبلات المعدلة للحصول على معلومات قيمة حول المحفزات والآليات الجزيئية التي تؤثر على الاتجار GluR. وبالمثل, ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة مستقبلات أخرى أو البروتينات السطحية أعرب.

ويستند هذا البروتوكول لدراسة الاتجار مستقبلات الغلوتامات على وضع العلامات التفاضلية للمستقبلات المعبر عنها في سطح الخلية وتلك التي أعرب عنها في الأغشية الداخلية. ويتحقق الفصل عن طريق وضع العلامات على المستقبلات قبل وبعد نفاذية الغشاء، وذلك باستخدام نفس الجسم المضاد ا?...

Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات الغلوتامات (GluR) الاتجار في الثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة. باستخدام نهج تغذية الأجسام المضادة لتسمية مستقبلات ذاتية أو مبالغ فيها في تركيبة مع النهج الدوائية، وهذا الأسلوب يسمح لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم التعبير سطح غلور عن طريق تحوير عمليات الاستيعاب الداخلي أو إعادة التدوير.

نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

تعتمد الاستجابات الخلوية للمحفزات الخارجية بشكل كبير على مجموعة البروتينات التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية في لحظة معينة. وبناء على ذلك، يتم التحكم بشكل حيوي في عدد هذه البروتينات، وتوطينها تحت الخلوية، وتكوينها الفرعي. هنا، سوف نستخدم نهج تغذية الأجسام المضادة لتحديد مستوى المستقبلات السطحية التي أعرب عنها في الثقافات الخلية، طالما أن استئناف استيعاب وإعادة التدوير.هذا هو بروتوكول تنوعا للغاية، التي توفر معلومات ميكانيكية لتنظيم البروتينات السطحية أعرب. في مثالنا، سوف ندرس مستقبلات الجلوتامين في الخلايا العصبية فرس النهر الأولية. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أي بروتين يمتلك epitope خارج الخلية، إذا لم تكن الأجسام المضادة متوفرة، يمكن أن يكون transvection من التشييد الموسومة مفيدة لكل من وضع العلامات ودراسة طفرات محددة.في الأمثلة لدينا، ونحن نستخدم الأجسام المضادة ضد GluA1 الذاتية، والموسومة Glu12 B.To تبدأ هذا الإجراء، ونقل غطاء زلات الجانب الخلية تصل إلى علبة غلاف الفيلم غطت، لحفظ الكواشف، وتسهيل التلاعب. حفظ وصيانة وسائل الإعلام مكيفة في 37 درجة مئوية للحضانة والخطوات الغسيل. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في وسائل الإعلام مكيفة، في درجة حرارة الغرفة، لمدة 15 دقيقة.بعد ذلك، استخدم ماصة فراغ لpirate بعناية قبالة الأجسام المضادة التي تحتوي على وسائل الإعلام، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الإعلام مكيفة. إذا دراسة سطح مقابل التعبير مستقبلات داخل الخلايا إصلاح الخلايا مع paraformaldehyde بعد هذه الخطوة، كما هو مبين في بروتوكول النص. الحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام مكيفة دون الأجسام المضادة، وإعادتها إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية للسماح لادعاب.إذا كان دراسة عملية استيعاب، إصلاح الخلايا مع شبه شكلي بعد هذه الخطوة، كما هو موضح في بروتوكول النص. لمنع epitopes على الأجسام المضادة الأولية تعلق على السطح عن المستقبلات التي لم يتم استيعابها، احتضان الخلايا مع شظايا الأجسام المضادة مضادة فاب غير مُجَنَّد IgG المخففة في وسائل الإعلام المُكيفة، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات بوسائط مكيفة.احتضان الآبار المغسولة مع وسائل الإعلام مكيفة تحتوي على 80 Dynasore micromolar، في 37 درجة مئوية، للسماح لإعادة تدوير المستقبلات الداخلية. بعد الانتهاء من التعديلات على الخلايا الحية، وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني زائد. إضافة حل من 4٪ شبهformaldehyde و 4٪ السكروز في برنامج تلفزيوني للخلايا، واحتضان في غطاء محرك الدخان في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع إلى ثماني دقائق، لإصلاح الخلايا.ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العادية. إضافة حل من مصل الماعز العادي 10٪ في برنامج تلفزيوني إلى الخلايا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، لمنع مواقع الربط غير محددة. المقبل، احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية الموسومة الفلورسنت مخففة في 3٪ NGS في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، لتسمية مستقبلات التسمية الأجسام المضادة الأولية.بعد هذا، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. للبدء في وضع العلامات على مستقبلات داخل الخلايا، إضافة محلول من 0.25٪ TritonX في برنامج تلفزيوني، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق، ل Permeabilize الخلايا. ثم كتلة مع 10٪ NGS في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.إذا دراسة السطح مقابل المجموع، احتضان الخلايا مع نفس الأجسام المضادة الأولية المستخدمة سابقا، مخففة مع 3٪ NGS في برنامج تلفزيوني، في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، لتسمية مستقبلات داخل الخلايا. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. تسمية مع ثاني fluorescently الموسومة الأجسام المضادة الثانوية، المخفف في 3٪ NGS في برنامج تلفزيوني، في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.بعد هذا يغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. أولاً بلطف وضع زلة الغطاء، الجانب الخلية إلى أسفل، على 12 إلى 15 ميكرولترات من وسائل الإعلام تركيب المناسبة لتركيب الخلايا. ثم صورة الخلايا على المجهر confocal المناسبة، وتحليل الخلايا كما هو مبين في بروتوكول النص.ويستند هذا البروتوكول لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات على العلامات التفاضلية للمستقبلات، التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية، وتلك التي يتم التعبير عنها في الأغشية الداخلية. بعد الحصول على الصور confocal، يمكن قياس إشارة الفلورسنت بسهولة لإظهار زيادة في التعبير السطحي، نسبة إلى السكان داخل الخلايا، بعد LTP الكيميائية. لا يمكن الحصول على أي إشارة ل PSD-95 في الخلايا غير مُمَيَّلة، مما يدل على سلامة غشاء البلازما.هذا يشير إلى أن الإشارة التي تم الحصول عليها لسطح GluA1 يتوافق في الواقع إلى مستقبلات سطح أعرب. الأهم من ذلك، يمكن ملاحظة إشارة أدنى لـ GluA1 الداخلية في ظل ظروف غير الحساسية، مما يدل على أن جميع الظهاريات السطحية مشغولة بالجولة الأولية من وضع العلامات على الأجسام المضادة. ثم يتم تحديد المستقبلات التي تم استيعابها.ويبرز هذا المثال أن فسفورة GluN2B في S1480 يعزز استيعاب المستقبلات. كما phosphomimetic متحولة S1480E عرض نسبة استيعاب أعلى بكثير مقارنة مع مستقبلات من نوع البرية. كما هو متوقع، يتم الحصول على أي إشارة لمستقبلات داخلي في عنصر التحكم.بعد ذلك، يتم تحديد المستقبلات المعاد تدويرها والمستقبلات الداخلية. وتبين نسبة إعادة التدوير المتولدة أن GluN2B S1480E ليس لها أي تأثير على إعادة تدوير NMDAR. في عنصر التحكم، يمكن ملاحظة إشارة قوية لسطح أعرب GluN2B في غياب حظر فاب.وتختفي هذه الإشارة في الثقافات المعالجة من قبل فاب، مما يدل على أن بروتوكول الحجب يكفي لحجب السطح المعبر عنه تماماً، وأن الإشارات السطحية التي لوحظت بعد إعادة التدوير تتوافق بالفعل مع المستقبلات التي يتم الاتجار بها مرة أخرى إلى غشاء البلازما. البروتوكول الحالي هو مجرد واحدة من الطرق المتاحة لدراسة تنظيم البروتينات السطحية المعبر عنها. ويمكن اتباع نهج أخرى لتوسيع نطاق البيانات التي تم الحصول عليها هنا أو التحقق منها.وتشمل هذه الطرق البيوكيميائية، مثل البيوتينيل، تقنيات تصوير الحياة، أو النهج الوظيفية، مثل الفيزيولوجيا الكهربائية أو تصوير الكالسيوم. نحن نستخدم PFA لتجميد توطين المستقبلات ، ومع ذلك فإن PFA مادة مسرطنة معروفة ، لذلك من المهم تنفيذ الخطوات باستخدام PFA تحت غطاء الدخان ، مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

غشاء المحتملة صبغ التصوير من بطني إنسي المهاد الخلايا العصبية من الفئران الكبار لدراسة الجلوكوز الاستشعار

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

شريط الفحص لدراسة آخر جذاب أو مثيرة للاشمئزاز من الركيزة البروتين عن طريق فصل الخلايا العصبية الحصين

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

منخفض الكثافة الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

أورجانوتيبيك شريحة هيبوكامبال الثقافات كنموذج للدراسة نيوروبروتيكتيون واختزاع الخلايا السرطانية

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...