Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

Vi takker nordvestlige Center for avanceret mikroskopi til brug af Nikon a1 Confocal mikroskop og deres assistance i planlægning og analyse af eksperimenter. Denne forskning blev støttet af NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), og NIA (R00AG041225) og en NARSAD Young Investigator Grant fra hjernen & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Arbejdet vedrørende hippocampus primær kultur forberedelse blev revideret og godkendt af det nordvestlige Universitets udvalg for dyrepasning og-anvendelse (protokol #IS00001151).
1. forberedelse før mærkning
<ol><li>
Klargøring og vedligeholdelse af primære hippocampus-kulturer
	<ol>
<li>Forbered primære hippocampus kulturer ved en tæthed på 150.000 celler belagt på poly-D-lysin-belagt (0,1 mg/mL) 18 mm Cover briller. Fremragende guider til dissocieret neuronal ku...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+(NMDA)+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+(AMPA)+Receptors+by+Posttranslational+Modifications.">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons.">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition:+Many+Regulators,+Many+Consequences.">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation.">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient.">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li><li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).</li></ol>

Interaktionen mellem en celle og dens omgivelser (f. eks. kommunikation med andre celler, respons på forskellige stimuli osv.) er stærkt afhængig af det korrekte udtryk af receptorer ved cellens overflade. Den hurtige og finjusterede regulering i overflade udtrykt receptor indhold muliggør korrekt cellulær respons på et miljø i konstant forandring. I det særlige tilfælde af neuroner, ændringer i antallet, lokalisering, og underenhed sammensætning af synaptisk udtrykte receptorer stærkt påvirker synaptisk kom...

Celler udnytter den aktive proces af menneskehandel til at mobilisere proteiner til specifikke subcellulære lokaliseringer og udøve streng spatiotemporale regulering over deres funktion1. Denne proces er især vigtigt for transmembran receptorer, som cellulære reaktioner på forskellige miljømæssige stimuli stole på intracellulære kaskader udløst af receptor aktivering. Celler er i stand til at ændre disse reaktioner ved at ændre tæthed, lokalisering, og underenhed sammensætning af receptorer udtrykt ved cellens overflade via receptor subcellulære handel regulation2. Indsættelse af nyligt syntetiserede receptorer i plasma membranen, sammen med endokytose og genanvendelse af eksisterende receptorer er eksempler på menneskehandel processer, der bestemmer netto puljen af overflade-udtrykte receptorer2. Mange molekylære mekanismer samarbejder om at regulere protein smugling, herunder protein-protein interaktioner og posttranslationelle modifikationer såsom fosforylering, allestedsnærværende eller palmitoylering2.
Regulering af receptor handel er især påkrævet i stærkt polariserede celler med højt specialiserede strukturer. Det paradigmatiske eksempel er kontrol af neuronal funktion af reguleret handel med glutamat receptorer (glurs)3,4. Glutamat, den vigtigste excitatoriske neurotransmitter, binder og aktiverer overflade-udtrykte glurs til at kontrollere grundlæggende fysiologiske neuronal funktioner såsom synaptisk neurotransmission og synaptisk plasticitet. Den kendsgerning, at ændret GluR-handel er blevet observeret i et bredt spektrum af neuropatier, der spænder fra neuroudviklingsmæssige lidelser til neurodegenerative sygdomme, fremhæver betydningen af denne proces5. Således forståelse af de molekylære begivenheder, der kontrollerer GluR handel er af interesse i mange områder af forskning.
I denne protokol anvendes en antistoffodrings baseret metode til at kvantificere niveauet af overflade-udtrykte GluRs i primær hippocampus neuroner samt evaluere, hvordan ændringer i internalisering og genanvendelse resulterer i den observerede netto overflade ekspression. Brugen af farmakologi og/eller overekspression af eksogene receptorer harkedeligt specifikke mutationer gør denne protokol en særlig kraftfuld tilgang til at studere molekylære mekanismer underliggende neuronal tilpasning til forskellige miljømæssige stimuli. Et sidste eksempel på nytten af denne protokol er at undersøge, hvordan multifaktorielle ændringer i miljøet (f. eks. i en sygdomsmodel) påvirker GluR-handel gennem undersøgelse af overflade ekspression i sådanne modeller.
Ved hjælp af specifikke eksempler, det er i første omgang demonstreret, hvordan en farmakologisk manipulation efterligner fysiologiske synaptisk stimulation [Chemical LTP (cltp)] øger overflade ekspression af den endogene GluA1 underenhed af AMPA-type af glurs (ampars) 6. ulovlig handel med overudtrykt phospho-mimetisk form af GluN2B underenhed af NMDA-type af GluRs (NMDARs) analyseres også for at eksemplificere, hvordan denne protokol kan anvendes til at studere reguleringen af GluR-handel ved specifikke posttranslationelle Ændringer. Selv om disse specifikke eksempler anvendes, denne protokol kan nemt anvendes til andre GluRs og andre receptorer og proteiner, der besidder antigene ekstracellulære domæner. I tilfælde af, at der ikke er antistoffer til rådighed for ekstracellulære domæner, over ekspression af ekstracellulære epitope-Tagged (f. eks flag-, MYC-, GFP-Tagged, etc.) proteiner kan hjælpe med protein mærkning.
Den nuværende protokol indeholder anvisninger til kvantificering af specifik GluR-subtype tæthed og handel med specifikke antistoffer. Denne protokol kan anvendes til at studere 1) total GluR overflade ekspression, 2) GluR internalisering, og 3) GluR genanvendelse. For at studere hver proces individuelt, anbefales det at begynde med afsnit 1 og 2 og fortsætte med enten afsnit 3, 4 eller 5. I alle tilfælde afsluttes med punkt 6 og 8 (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Cellulære reaktioner på eksterne stimuli er stærkt afhængige af det sæt af receptorer, der udtrykkes ved cellens overflade på et givet tidspunkt. Derfor er populationen af overflade-udtrykte receptorer konstant tilpasning og underlagt strenge reguleringsmekanismer. Det paradigmatiske eksempel og en af de mest studerede menneskehandel begivenheder i biologi er den regulerede kontrol af det synaptiske udtryk af glutamat receptorer (GluRs). GluRs mægle langt størstedelen af excitatoriske neurotransmission i det centrale nervesystem og kontrollere fysiologiske aktivitets afhængige funktionelle og strukturelle ændringer på den synaptiske og neuronal niveauer (f. eks, synaptisk plasticitet). Ændringer i antallet, placering, og underenhed sammensætning af overflade udtrykt glurs dybt påvirke neuronal funktion og, i virkeligheden, ændringer i disse faktorer er forbundet med forskellige neuropatier. Præsenteret her er en metode til at studere GluR handel i dissocierede hippocampus primære neuroner. En "antistof-fodring" tilgang anvendes til differentielt visualisere GluR populationer udtrykt ved overfladen og indre membraner. Ved at mærkning overflade receptorer på levende celler og fastsættelse dem på forskellige tidspunkter for at give mulighed for receptorer endokytose og/eller genanvendelse, disse menneskehandel processer kan evalueres og selektivt undersøgt. Dette er en alsidig protokol, der kan anvendes i kombination med farmakologiske tilgange eller over ekspression af ændrede receptorer for at få værdifuld information om stimuli og molekylære mekanismer, som påvirker GluR-handel. Tilsvarende kan det let tilpasses til at studere andre receptorer eller overflade udtrykte proteiner.

Denne protokol til at studere glutamat receptor handel er baseret på differentiel mærkning af receptorer udtrykt ved cellens overflade og dem, der udtrykkes i indre membraner. Adskillelse opnås ved mærkning af receptorerne før og efter membran permeabilisering, ved hjælp af samme primære antistof, men et sekundært antistof konjugeret til en anden fluorophore. Som skitseret af de valgfrie trin inkluderet protokollen, dette er en meget alsidig metode til at forhør forskellige recep...

Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Denne artikel præsenterer en metode til at studere glutamat receptor (GluR) handel med dissocierede primære hippocampus kulturer. Ved hjælp af en antistof-fodring tilgang til at mærke endogene eller over udtrykte receptorer i kombination med farmakologiske tilgange, denne metode giver mulighed for identifikation af molekylære mekanismer regulerer GluR overflade ekspression ved at moduere internaliserings-eller genanvendelsesprocesser.

En antistof fodring tilgang til at studere glutamat receptor handel i dissocierede primære hippocampus kulturer

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Cellulære reaktioner på eksterne stimuli stærkt stole på det sæt af proteiner, der er udtrykt på celleoverfladen i et givet øjeblik. Derfor er antallet, den subcellulære lokalisering og underenhedssammensætningen af disse proteiner dynamisk kontrolleret. Her vil vi bruge en antistoffodringstilgang til at kvantificere niveauet af overflade udtrykte receptorer i cellekulturer, så længe internaliseringen og genanvendelsen genoptages.Dette er en meget alsidig protokol, der giver mekanistiske oplysninger om reguleringen af overflade udtrykte proteiner. I vores eksempel vil vi studere glutaminreceptorer i primære hippocampale neuroner. Denne protokol kan tilpasses ethvert protein, der besidder en anagenisk ekstracellulær epitop, hvis antistoffer ikke er tilgængelige, kan transvektion af mærkede konstruktioner være nyttig for både mærkning og undersøgelse af specifikke mutationer.I vores eksempler bruger vi antistoffer mod endogene GluA1, og mærkede Glu12 B.To begynder denne procedure, overføre dæksel celle side op til en paraffin film dækket bakke, for at spare reagenser, og lette manipulation. Gem og vedligeholde betingede medier ved 37 grader Celsius for inkubation og vask trin. Inkuber cellerne med primære antistoffer fortyndet i konditionerede medier ved stuetemperatur i 15 minutter.Derefter skal du bruge en vakuumpipette til omhyggeligt at aspirere antistoffet, der indeholder medier, og vaske cellerne tre gange med betinget medie. Hvis man studerer overflade versus intracellulær receptor udtryk fastsætte cellerne med paraformaldehyd efter dette trin, som skitseret i tekstprotokollen. Vedligehold cellerne i betinget medie uden antistoffer, og returnere dem til inkubatoren ved 37 grader Celsius for at give mulighed for internalisering.Hvis du studerer internaliseringsproces, skal du rette cellerne med paraformaldehyd efter dette trin, som beskrevet i tekstprotokollen. For at blokere epitoperne på det primære antistof, der er fastgjort til overfladen, er de udtrykte receptorer, der ikke er blevet internaliseret, inkuberes celler med ukonjugerede Fab anti-IgG-antistoffragmenter fortyndet i betinget medie i 20 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes cellerne tre gange med betinget medie.Inkuber de vaskede brønde med konditionerede medier, der indeholder 80 mikromolar Dynasore, ved 37 grader Celsius, for at give mulighed for genanvendelse af internaliserede receptorer. Efter endt ændringer på levende celler, vaske cellerne én gang med PBS plus. Tilsæt en opløsning på 4% paraformaldehyd og 4% saccharose i PBS til cellerne, og inkuberes i en røghætte ved stuetemperatur i syv til otte minutter, for at fastsætte cellerne.Derefter vaskes cellerne tre gange med almindelig PBS. Tilføj en opløsning på 10% Normal Gedeserum i PBS til cellerne, og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter for at blokere ikke-specifikke bindingssteder. Dernæst inkubere cellerne med fluorescerende mærkede sekundære antistof fortyndet i 3% NGS i PBS ved stuetemperatur i en time, at mærke primære antistof etiket receptorer.Derefter vaskes cellerne tre gange med PBS. For at begynde at mærke de intracellulære receptorer, tilsættes en opløsning på 0,25% TritonX i PBS, og inkubere ved stuetemperatur i fem til 10 minutter, at permeabilize cellerne. Derefter blokere med 10% NGS ved stuetemperatur i 30 minutter.Hvis man studerer overflade versus total, inkuberes cellerne med det samme primære antistof, der tidligere blev anvendt, fortyndet med 3% NGS i PBS ved stuetemperatur i en time for at mærke de intracellulære receptorer. Vask derefter cellerne tre gange med PBS. Etiket med andet fluorescerende mærkede sekundært antistof, fortyndet i 3% NGS i PBS, ved stuetemperatur i en time.Herefter vaskes cellerne tre gange med PBS. Først forsigtigt placere dækslet glider, cellesiden ned, på 12 til 15 mikroliter af de relevante monteringsmedier til at montere cellerne. Billede derefter cellerne på det relevante konfokale mikroskop, og analyser cellerne som beskrevet i tekstprotokollen.Denne protokol til undersøgelse glutamat receptor handel er baseret på differentieret mærkning af receptorer, udtrykt på celleoverfladen, og dem, der udtrykkes i interne membraner. Efter erhvervelse af konfokale billeder, kan fluorescerende signal let kvantificeres for at vise en stigning i overfladeudtryk, i forhold til intracellulære population, efter kemisk LTP. Intet signal til PSD-95 kan opnås i ikke-permeabiliserede celler, der viser plasmamembranens integritet.Dette indikerer, at det signal, der opnås for overfladen GluA1 faktisk svarer til overflade udtrykt receptorer. Vigtigere er det, et minimalt signal for internaliseret GluA1 kan observeres under ikke-permeabilization betingelser, der viser, at alle overflade epitoper er besat af den indledende runde af antistof mærkning. Receptorer, der er blevet internaliseret, identificeres derefter.Dette eksempel fremhæver, at GluN2B fosforylering på S1480 fremmer receptor internalisering. Som den fosfomimetiske mutant S1480E viste et meget højere internaliseringsforhold sammenlignet med wild-type receptorer. Som forventet opnås der intet signal for internaliserede receptorer i styringen.Dernæst identificeres genanvendte receptorer og internaliserede receptorer. Den genererede genanvendelsesforhold viser, at GluN2B S1480E ikke har nogen effekt på NMDAR-genanvendelse. I styringen kan der observeres et stærkt signal for overfladen udtrykt GluN2B i mangel af Fab-blokering.Dette signal forsvinder i Fab-behandlede kulturer, hvilket viser, at blokeringsprotokollen er tilstrækkelig til helt at blokere overfladen udtrykt epitoper, og at de overfladesignaler, der observeres efter genanvendelse, faktisk svarer til receptorer, der smugles tilbage til plasmamembranen. Den nuværende protokol er blot en af de metoder, der er til rådighed til at undersøge reguleringen af overflade udtrykte proteiner. Andre tilgange kan anvendes til at udvide eller kontrollere de data, der er indhentet her.Disse omfatter biokemiske metoder, som biotinylation, liv billeddannelse teknikker, eller funktionelle tilgange, som elektrofysiologi eller calcium billeddannelse. Vi bruger PFA til at fryse lokaliseringen af receptorer, men PFA er et kendt kræftfremkaldende stof, så det er afgørende at udføre trin ved hjælp af PFA under en røghætte, mens iført passende PPE.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat Transfektion af primær hippocampusneuroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Membranpotentialet Dye Imaging af ventromedial Hypothalamus neuroner fra voksne mus til Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Ved hjælp af en α-Bungarotoxin-bindingssted Tag til Study GABAA receptor membranlokalisering og handel

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen af ​​neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay til at studere den attraktiv eller Repulsive aktivitet af et protein underlaget med Dissocierede hippocampusneuroner

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density Primær Hippocampal neuronkultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic hippocampus skive kulturer som en Model til undersøgelse Neuroprotection og invasionsevne af tumorceller

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...