Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

We danken het noordwestelijke centrum voor geavanceerde microscopie voor het gebruik van de Nikon a1 confocale Microscoop en hun hulp bij het plannen en analyseren van de experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) en NIA (R00AG041225) en een NARSAD Young Investigator subsidie van de Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Werk met betrekking tot de voorbereiding van de primaire cultuur van hippocampal werd beoordeeld en goedgekeurd door het noordwestelijke universitair Dierenzorg-en gebruiks Comité (protocol #IS00001151).
1. voorbereiding voor het labelen
<ol><li>
Bereiding en onderhoud van primaire hippocampal culturen
	<ol>
<li>Bereid primaire hippocampal culturen met een dichtheid van 150.000 cellen verguld op poly-D-Lysine-gecoate (0,1 mg/mL) 18 mm afdek glazen. Uitstekende gidsen voor d...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+(NMDA)+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+(AMPA)+Receptors+by+Posttranslational+Modifications.">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons.">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition:+Many+Regulators,+Many+Consequences.">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation.">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient.">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li><li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).</li></ol>

De interactie tussen een cel en zijn omgeving (bijv. communicatie met andere cellen, reactie op verschillende stimuli, enz.) is sterk afhankelijk van de juiste expressie van receptoren op het celoppervlak. De snelle en fijngetunede regulering in oppervlakte-uitgedrukt receptor inhoud zorgt voor een goede cellulaire reactie op een voortdurend veranderende omgeving. In het specifieke geval van neuronen, wijzigingen in het aantal, lokalisatie, en de samenstelling van de subeenheid van Synaptisch uitgedrukt receptoren sterk ...

Cellen maken gebruik van het actieve proces van handel om eiwitten te mobiliseren voor specifieke subcellulaire lokalisaties en het uitoefenen van strikte spatiotemporele regulering over hun functie1. Dit proces is vooral belangrijk voor transmembraan receptoren, als cellulaire reacties op verschillende milieu stimuli vertrouwen op intracellulaire Cascades veroorzaakt door receptor activering. Cellen zijn in staat om deze reacties te wijzigen door het veranderen van de dichtheid, lokalisatie, en subeenheid samenstelling van receptoren uitgedrukt op het celoppervlak via receptor subcellulaire handel voorschrift2. Het inbrengen van nieuw worden receptoren in het plasma membraan, samen met endocytose en recycling van bestaande receptoren zijn voorbeelden van mensenhandel processen die bepalen de netto pool van oppervlakte-uitgedrukt receptoren2. Veel moleculaire mechanismen werken samen om de eiwit handel te reguleren, waaronder eiwit-eiwit interacties en posttranslationele modificaties zoals fosforylering, Ubiquitination of palmitoylation2.
Regulering van de receptor handel is met name vereist in sterk gepolariseerde cellen met zeer gespecialiseerde structuren. Het paradigmatische voorbeeld is de controle van neuronale functie door gereguleerde handel in glutamaat receptoren (glurs)3,4. Glutamaat, de belangrijkste excitatory neurotransmitter, bindt en activeert oppervlak-uitgedrukt GluRs voor het beheersen van fundamentele fysiologische neuronale functies zoals synaptische transmission en synaptische plasticiteit. Het feit dat veranderde GluR handel is waargenomen in een breed spectrum van neuropathieën, variërend van neuroontwikkelingsstoornissen tot neurodegeneratieve ziekten, benadrukt het belang van dit proces5. Het begrijpen van de moleculaire gebeurtenissen die de handel in GluR beheersen, is dus interessant voor veel onderzoeksgebieden.
In dit protocol wordt een methode op basis van antilichamen gebruikt om het niveau van oppervlakte-uitgedrukt GluRs in primaire hippocampale neuronen te kwantificeren en te evalueren hoe veranderingen in internalisatie en recycling resulteren in de waargenomen netto-oppervlakte uitdrukking. Het gebruik van farmacologie en/of overexpressie van exogene receptoren die specifieke mutaties verteren maakt dit protocol een bijzonder krachtige benadering voor het bestuderen van moleculaire mechanismen onderliggende neuronale aanpassing aan verschillende milieu stimuli. Een laatste voorbeeld van het nut van dit protocol is het bestuderen van de invloed van de multifactoriële veranderingen in het milieu (zoals in een ziekte model) op de handel in GluR door het onderzoek van de oppervlakte expressie in dergelijke modellen.
Met behulp van specifieke voorbeelden, het is in eerste instantie aangetoond hoe een farmacologische manipulatie nabootsen van fysiologische synaptische stimulatie [Chemical LTP (cLTP)] verhoogt de oppervlakte uitdrukking van de endogene GluA1 subeenheid van de AMPA-type van GluRs (AMPARs) 6. de handel in een overuitgedrukt fosho-mimetische vorm van de GluN2B subeenheid van het NMDA-type GluRs (NMDARs) wordt ook geanalyseerd om te illustreren hoe dit protocol kan worden gebruikt om de regulering van de GluR-handel te bestuderen door specifieke posttranslationele Wijzigingen. Hoewel deze specifieke voorbeelden worden gebruikt, kan dit protocol gemakkelijk worden toegepast op andere gluren en andere receptoren en eiwitten die antigene extracellulaire domeinen bezitten. In het geval dat er geen antilichamen beschikbaar zijn voor extracellulaire domeinen, overexpressie van extracellulaire epitope-Tagged (bijv., vlag-, Myc-, GFP-Tagged, enz.) eiwitten kunnen helpen bij de etikettering van eiwitten.
Het huidige protocol bevat instructies voor het kwantificeren van specifieke GluR-subtype dichtheid en mensenhandel met specifieke antilichamen. Dit protocol kan worden gebruikt om te bestuderen 1) totaal GluR oppervlakte expressie, 2) GluR internalisatie, en 3) GluR recycling. Om elk proces afzonderlijk te bestuderen, wordt geadviseerd om te beginnen met de secties 1 en 2 en door te gaan met sectie 3, 4 of 5. In alle gevallen, eindig met secties 6 en 8 (Figuur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Cellulaire reacties op externe stimuli sterk vertrouwen op de set van receptoren uitgedrukt in het celoppervlak op een bepaald moment. Dienovereenkomstig, de populatie van oppervlakte-uitgedrukte receptoren is voortdurend aan te passen en onderworpen aan strenge mechanismen van regulering. Het paradigmatische voorbeeld en een van de meest bestudeerde evenementen in de biologie is de gereguleerde controle van de synaptische expressie van glutamaat receptoren (GluRs). GluRs bemiddelen de overgrote meerderheid van de excitatory transmissie in het centrale zenuwstelsel en controle fysiologische activiteit-afhankelijke functionele en structurele veranderingen op de synaptische en neuronale niveaus (bijv., synaptische plasticiteit). Wijzigingen in het aantal, de locatie en de subeenheid samenstelling van het oppervlak uitgedrukt glurs diep beïnvloeden neuronale functie en, in feite, wijzigingen in deze factoren worden geassocieerd met verschillende neuropathieën. Hier gepresenteerd is een methode om glur-handel in gezien hippocampal primaire neuronen te bestuderen. Een "antilichaam-voedende" benadering wordt gebruikt voor het differentieel visualiseren van GluR populaties uitgedrukt op het oppervlak en inwendige membranen. Door het labelen van de oppervlakte-receptoren op levende cellen en het oplossen van hen op verschillende tijdstippen voor receptoren endocytose en/of recycling, deze handel processen kunnen worden geëvalueerd en selectief bestudeerd. Dit is een veelzijdig protocol dat kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische benaderingen of overexpressie van veranderde receptoren om waardevolle informatie te verkrijgen over stimuli en moleculaire mechanismen die de handel in GluR beïnvloeden. Evenzo, het kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van andere receptoren of oppervlakte uitgedrukt eiwitten.

Dit protocol om te studeren glutamaat-receptor handel is gebaseerd op differentiële labeling van receptoren uitgedrukt op het celoppervlak en die uitgedrukt in interne membranen. Segregatie wordt bereikt door het labelen van de receptoren voor en na membraan permeisatie, met behulp van hetzelfde primaire antilichaam, maar een secundair antilichaam geconjugeerd aan een verschillende fluorophore. Zoals uiteengezet in de optionele stappen omvatte het Protocol, dit is een zeer veelzijdige me...

Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Cellulaire reacties op externe stimuli zijn sterk afhankelijk van de set eiwitten die op een bepaald moment op het celoppervlak worden uitgedrukt. Dienovereenkomstig worden het getal, de subcellulaire lokalisatie en subeenhedensamenstelling van deze eiwitten dynamisch gecontroleerd. Hier zullen we een antilichaamvoedingsbenadering gebruiken om het niveau van oppervlakte-uitgedrukte receptoren in celculturen te kwantificeren, zolang de internalisatie en recycling worden hervat.Dit is een zeer veelzijdig protocol, dat mechanistische informatie geeft over de regulatie van oppervlakteuitdrukte eiwitten. In ons voorbeeld zullen we glutaminereceptoren bestuderen in primaire hippocampalneurs. Dit protocol kan worden aangepast aan elk eiwit met een anagene extracellulaire epitoop, als antilichamen niet beschikbaar zijn, kan transvection van gelabelde constructies nuttig zijn voor zowel etikettering als het bestuderen van specifieke mutaties.In onze voorbeelden gebruiken we antilichamen tegen endogene GluA1, en gelabeld Glu12 B.To deze procedure te starten, de cover slips celzijde over te brengen naar een paraffine film overdekte lade, om reagentia op te slaan, en manipulatie te vergemakkelijken. Bewaar en onderhoud geconditioneerde media op 37 graden Celsius voor incubatie- en wasstappen. Incubeer de cellen met primaire antilichamen verdund in geconditioneerde media, bij kamertemperatuur, gedurende 15 minuten.Gebruik hierna een vacuümpipet om het antilichaam met media zorgvuldig aan te trekken en de cellen drie keer te wassen met geconditioneerde media. Als het bestuderen van oppervlakte versus intracellulaire receptorexpressie de cellen met paraformaldehyde na deze stap bevestigt, zoals beschreven in het tekstprotocol. Houd de cellen in geconditioneerde media zonder antilichamen, en breng ze terug naar de couveuse op 37 graden Celsius om internalisatie mogelijk te maken.Als u het internalisatieproces bestudeert, stelt u de cellen na deze stap met paraformaldehyde vast, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de epitopen op het primaire antilichaam aan het oppervlak te blokkeren uitgedrukte receptoren die niet zijn geïnternaliseerd, broeden cellen uit met ongeconsjoegeerde Fab anti-IgG antilichaamfragmenten verdund in geconditioneerde media, gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Daarna was je de cellen drie keer met geconditioneerde media.Broed de gewassen putten uit met geconditioneerde media met 80 micromolar Dynasore, bij 37 graden Celsius, om recycling van geïnternaliseerde receptoren mogelijk te maken. Na het beëindigen van de wijzigingen op levende cellen, was de cellen een keer met PBS plus. Voeg een oplossing van 4% paraformaldehyde en 4% sacharose in PBS toe aan de cellen en broed in een rookkap bij kamertemperatuur gedurende zeven tot acht minuten, om de cellen te fixeren.Was vervolgens de cellen drie keer met gewone PBS. Voeg een oplossing van 10%Normal Goat Serum in PBS toe aan de cellen en broed 30 minuten bij kamertemperatuur in om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Vervolgens, incubeer de cellen met fluorescerend gelabeld secundairantilichaam verdund in 3%NGS in PBS bij kamertemperatuur gedurende een uur, om primaire antilichaam label receptoren label.Was hierna de cellen drie keer met PBS. Om te beginnen met het labelen van de intracellulaire receptoren, voeg een oplossing van 0,25%TritonX in PBS, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf tot 10 minuten, om de cellen te permeabiliseren. Blokkeer vervolgens met 10%NGS op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Als het bestuderen van het oppervlak versus totaal, incubeer de cellen met dezelfde primaire antilichaam eerder gebruikt, verdund met 3%NGS in PBS, bij kamertemperatuur gedurende een uur, om de intracellulaire receptoren label. Was vervolgens de cellen drie keer met PBS. Label met tweede fluorescerend gelabeld secundair antilichaam, verdund in 3%NGS in PBS, bij kamertemperatuur gedurende een uur.Na deze wasbeurt de cellen drie keer met PBS. Plaats eerst voorzichtig de afdekkingslips, de celzijde naar beneden, op 12 tot 15 microliters van de juiste montagemedia om de cellen te monteren. Beeld vervolgens de cellen op de juiste confocale microscoop en analyseer de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Dit protocol voor het bestuderen van glutamaat receptor handel is gebaseerd op differentiële etikettering van receptoren, uitgedrukt aan het celoppervlak, en die uitgedrukt in interne membranen. Na het verkrijgen van confocale beelden kan het fluorescerende signaal gemakkelijk worden gekwantificeerd om een toename van de oppervlakteexpressie te laten zien, ten opzichte van intracellulaire populatie, na chemische LTP. Er kan geen signaal voor PSD-95 worden verkregen in niet-permeabiliseerde cellen, wat de integriteit van het plasmamembraan aantoont.Dit geeft aan dat het signaal verkregen voor het oppervlak GluA1 inderdaad overeenkomt met oppervlakte uitgedrukt receptoren. Belangrijk is dat een minimaal signaal voor geïnternaliseerde GluA1 kan worden waargenomen onder niet-permeabilisatieomstandigheden, waaruit blijkt dat alle oppervlakte-epitopen worden bezet door de eerste ronde van antilichaam etikettering. Receptoren die zijn geïnternaliseerd worden vervolgens geïdentificeerd.Dit voorbeeld benadrukt dat GluN2B fosforylatie bij S1480 receptor internalisatie bevordert. Zoals de fosfoomimetische mutant S1480E toonde een veel hogere internalisatie verhouding in vergelijking met wild-type receptoren. Zoals verwacht, wordt er geen signaal verkregen voor geïnternaliseerde receptoren in de controle.Vervolgens worden gerecycleerde receptoren en geïnternaliseerde receptoren geïdentificeerd. De gegenereerde recyclingratio laat zien dat GluN2B S1480E geen effect heeft op NMDAR-recycling. In de controle, kan een sterk signaal voor oppervlakte uitgedrukt GluN2B in de afwezigheid van Fab blokkeren worden waargenomen.Dit signaal verdwijnt in met Fab behandelde culturen, waaruit blijkt dat het blokkeringsprotocol voldoende is om het oppervlak dat epitopen uitdrukt volledig te blokkeren en dat de oppervlaktesignalen die na recycling worden waargenomen inderdaad overeenkomen met receptoren die naar het plasmamembraan worden verhandeld. Het huidige protocol is slechts een van de methoden die beschikbaar zijn voor het bestuderen van de regulatie van oppervlakte uitgedrukte eiwitten. Andere benaderingen kunnen worden genomen om de hier verkregen gegevens uit te breiden of te verifiëren.Deze omvatten biochemische methoden, zoals biotinylation, life imaging technieken, of functionele benaderingen, zoals elektrofysiologie of calcium imaging. We gebruiken PFA om de lokalisatie van receptoren te bevriezen, maar PFA is een bekende kankerverwekkende stof, dus het is cruciaal om stappen uit te voeren met PFA onder een rookkap, terwijl het dragen van de juiste PPE.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypische hippocampus Slice culturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Membraanpotentiaal Dye beeldvorming van ventromedial hypothalamus neuronen van volwassen muizen om te studeren Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...