Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
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Nous remercions le Northwestern Center for Advanced Microscopy pour l'utilisation du microscope Nikon A1 Confocal et leur aide dans la planification et l'analyse des expériences. Cette recherche a été appuyée par nigMS (T32GM008061) (A. M. C.), ni NIA (R00AG041225) et une subvention de jeunes chercheurs du NARSAD de la Brain and Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).

Les travaux relatifs à la préparation de la culture primaire hippocampal ont été examinés et approuvés par le Northwestern University Animal Care and Use Committee (protocole #IS00001151).
1. Préparation avant l'étiquetage
<ol><li>
Préparation et entretien des cultures hippocampiques primaires
	<ol>
<li>Préparer les cultures hippocampales primaires à une densité de 150 000 cellules plaquées sur des verres de couverture de 18 mm recouverts de poly-D-lysine (0,1 m...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. 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L'interaction entre une cellule et son environnement (par exemple, la communication avec d'autres cellules, la réponse à différents stimuli, etc.) repose fortement sur l'expression correcte des récepteurs à la surface de la cellule. La régulation rapide et affinée du contenu des récepteurs expriméens en surface permet une réponse cellulaire appropriée à un environnement en constante évolution. Dans le cas particulier des neurones, des altérations dans le nombre, la localisation, et la composition de subunit...

Les cellules utilisent le processus actif de trafic pour mobiliser les protéines à des localisations sous-cellulaires spécifiques et exercer une réglementation spatiotemporal stricte sur leur fonction1. Ce processus est particulièrement important pour les récepteurs transmembranaires, car les réponses cellulaires à différents stimuli environnementaux reposent sur des cascades intracellulaires déclenchées par l'activation des récepteurs. Les cellules sont capables de modifier ces réponses en modifiant la densité, la localisation et la composition sous-unité des récepteurs exprimés à la surface des cellules par le biais de la régulation du trafic sous-cellulaire des récepteurs2. L'insertion de récepteurs nouvellement synthétisés dans la membrane plasmatique, ainsi que l'endocytose et le recyclage des récepteurs existants sont des exemples de processus de traite qui déterminent le pool net de récepteurs exprimés en surface2. De nombreux mécanismes moléculaires coopèrent pour réguler le trafic de protéines, y compris les interactions protéines-protéines et les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l'ubiquitination ou la palmitoylation2.
La régulation du trafic de récepteurs est particulièrement nécessaire dans les cellules fortement polarisées avec des structures hautement spécialisées. L'exemple paradigmatique est le contrôle de la fonction neuronale par le trafic réglementé des récepteurs du glutamate (GluRs)3,4. Le glutamate, le principal neurotransmetteur excitateur, lie et active les GluRs exprimés en surface pour contrôler les fonctions neuronales physiologiques fondamentales telles que la neurotransmission synaptique et la plasticité synaptique. Le fait que le trafic altéré de GluR a été observé dans un large éventail de neuropathies, allant des désordres neurodevelopmental aux maladies neurodegenerative, accentue l'importance de ce processus5. Ainsi, la compréhension des événements moléculaires qui contrôlent le trafic de GluR est d'intérêt dans de nombreux domaines de recherche.
Dans ce protocole, une méthode basée sur l'alimentation des anticorps est utilisée pour quantifier le niveau de GluRs exprimés en surface dans les neurones hippocampiques primaires ainsi que pour évaluer comment les changements dans l'internalisation et le recyclage entraînent l'expression de surface nette observée. L'utilisation de la pharmacologie et/ou de la surexpression de récepteurs exogènes abritant des mutations spécifiques fait de ce protocole une approche particulièrement puissante pour l'étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à l'adaptation neuronale à différents stimuli environnementaux. Un dernier exemple de l'utilité de ce protocole est d'étudier comment les changements multifactoriels dans l'environnement (comme dans les modèles de maladie) affectent le trafic de GluR par l'examen de l'expression de surface dans de tels modèles.
À l'aide d'exemples spécifiques, il est d'abord démontré comment une manipulation pharmacologique imitant la stimulation synaptique physiologique [LTP chimique (cLTP)] augmente l'expression de surface de la sous-unité endogène GluA1 du type AMPA de GluRs (AMPA) 6. Le trafic d'une forme phospho-mimétique surexprimée de la sous-unité GluN2B de Type NMDA de GluR (NMDA) est également analysé pour illustrer comment ce protocole peut être utilisé pour étudier la régulation du trafic de GluR par modifications. Bien que ces exemples spécifiques soient utilisés, ce protocole peut facilement être appliqué à d'autres GluRs et d'autres récepteurs et protéines qui possèdent des domaines extracellulaires antigéniques. Dans le cas où il n'y a pas d'anticorps disponibles pour les domaines extracellulaires, la surexpression des protéines épitopères extracellulaires (p. ex. Flag-, Myc-, GFP-tagged, etc.) peut aider à l'étiquetage des protéines.
Le protocole actuel fournit des instructions pour quantifier la densité et le trafic spécifiques du sous-type GluR à l'aide d'anticorps spécifiques. Ce protocole peut être utilisé pour étudier 1) l'expression totale de surface de GluR, 2) l'internalisation de GluR, et 3) le recyclage de GluR. Pour étudier chaque processus individuellement, il est conseillé de commencer par les articles 1 et 2 et de continuer avec les sections 3, 4 ou 5. Dans tous les cas, terminez avec les sections 6 et 8 (figure1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Les réponses cellulaires aux stimuli externes dépendent fortement de l'ensemble des récepteurs exprimés à la surface de la cellule à un moment donné. En conséquence, la population de récepteurs exprimés en surface s'adapte constamment et est soumise à des mécanismes stricts de régulation. L'exemple paradigmatique et l'un des événements de trafic les plus étudiés en biologie est le contrôle réglementé de l'expression synaptique des récepteurs du glutamate (GluRs). Les GluRs sont la médiation de la grande majorité de la neurotransmission excitatrice dans le système nerveux central et contrôlent les changements fonctionnels et structurels dépendants de l'activité physiologique aux niveaux synaptique et neuronal (p. ex., plasticité synaptique). Les modifications dans le nombre, l'emplacement, et la composition de sous-unité de la surface exprimée GluRs affectent profondément la fonction neuronale et, en fait, les changements dans ces facteurs sont associés à différentes neuropathies. Présenté ici est une méthode pour étudier le trafic de GluR dans les neurones primaires hippocampiques dissociés. Une approche d'« alimentation par anticorps » est utilisée pour visualiser différemment les populations de GluR exprimées à la surface et aux membranes internes. En étiquetant les récepteurs de surface sur les cellules vivantes et en les fixant à des moments différents pour permettre l'endocytose des récepteurs et/ou le recyclage, ces processus de trafic peuvent être évalués et étudiés de manière sélective. Il s'agit d'un protocole polyvalent qui peut être utilisé en combinaison avec des approches pharmacologiques ou la surexpression des récepteurs modifiés pour obtenir des informations précieuses sur les stimuli et les mécanismes moléculaires affectant le trafic de GluR. De même, il peut être facilement adapté pour étudier d'autres récepteurs ou protéines exprimées en surface.

Ce protocole pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate est basé sur l'étiquetage différentiel des récepteurs exprimés à la surface de la cellule et ceux exprimés dans les membranes internes. La ségrégation est réalisée par l'étiquetage des récepteurs avant et après la perméabilisation de la membrane, en utilisant le même anticorps primaire, mais un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore différent. Comme le décrivent les étapes facultatives incluses d...

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An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.

Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Les réponses cellulaires aux stimuli externes reposent fortement sur l’ensemble des protéines qui sont exprimées à la surface de la cellule à un moment donné. Par conséquent, le nombre, la localisation sous-cellulaire et la composition sous-unique de ces protéines sont contrôlés dynamiquement. Ici, nous utiliserons une approche d’alimentation anticorps pour quantifier le niveau de récepteurs exprimés en surface dans les cultures cellulaires, tant que l’internalisation et le recyclage reprendront.Il s’agit d’un protocole très polyvalent, qui fournit des informations mécanistes de la régulation des protéines exprimées en surface. Dans notre exemple, nous étudierons les récepteurs de glutamine dans les neurones hippocampaux primaires. Ce protocole peut être adapté à toute protéine possédant un épitope extracellulaire angénique, si les anticorps ne sont pas disponibles, la transvection des constructions marquées peut être utile à la fois pour l’étiquetage et l’étude de mutations spécifiques.Dans nos exemples, nous utilisons des anticorps contre glua1 endogène, et marqué Glu12 B.To commencer cette procédure, transférer le côté de la cellule de glissements de couverture jusqu’à un plateau couvert de film de paraffine, pour sauver les reagents, et faciliter la manipulation. Économisez et maintenez les supports conditionnés à 37 degrés Celsius pour les étapes d’incubation et de lavage. Incuber les cellules avec des anticorps primaires dilués dans des supports conditionnés, à température ambiante, pendant 15 minutes.Après cela, utilisez une pipette sous vide pour aspirer soigneusement l’anticorps contenant des supports, et laver les cellules trois fois avec des supports conditionnés. Si l’étude de l’expression des récepteurs de surface par rapport aux récepteurs intracellulaires fixe les cellules avec du paraformaldéhyde après cette étape, comme décrit dans le protocole de texte. Maintenir les cellules dans des supports conditionnés sans anticorps, et les retourner à l’incubateur à 37 degrés Celsius pour permettre l’internalisation.Si vous étudiez le processus d’internalisation, fixez les cellules avec du paraformaldéhyde après cette étape, comme indiqué dans le protocole de texte. Pour bloquer les épitopes de l’anticorps primaire attaché à la surface des récepteurs exprimés qui n’ont pas été intériorisés, incubez des cellules avec des fragments d’anticorps Fab anti-IgG non poursuivis dilués dans des supports conditionnés, pendant 20 minutes à température ambiante. Après cela, laver les cellules trois fois avec des supports conditionnés.Incuber les puits lavés avec des supports conditionnés contenant 80 micromolaires Dynasore, à 37 degrés Celsius, pour permettre le recyclage des récepteurs intériorisés. Après avoir terminé les modifications sur les cellules vivantes, laver les cellules une fois avec PBS plus. Ajoutez une solution de 4% de paraformaldéhyde et 4% de saccharose en PBS aux cellules, et incubez dans un capot de fumée à température ambiante pendant sept à huit minutes, pour fixer les cellules.Lavez ensuite les cellules trois fois avec du PBS régulier. Ajoutez une solution de sérum de chèvre normal de 10% dans PBS aux cellules, et incubez à température ambiante pendant 30 minutes, pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Ensuite, incuber les cellules avec des anticorps secondaires étiquetés fluorescents dilués en 3%NGS dans PBS à température ambiante pendant une heure, pour étiqueter les récepteurs primaires d’étiquette d’anticorps.Après cela, laver les cellules trois fois avec PBS. Pour commencer à étiqueter les récepteurs intracellulaires, ajoutez une solution de 0,25% TritonX dans PBS, et incubez à température ambiante pendant cinq à 10 minutes, pour perméabiliser les cellules. Ensuite, bloquer avec 10%NGS à température ambiante pendant 30 minutes.Si vous étudiez la surface par rapport au total, incubez les cellules avec le même anticorps primaire utilisé précédemment, dilué avec 3% de NGS dans PBS, à température ambiante pendant une heure, pour étiqueter les récepteurs intracellulaires. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec PBS. Étiquette avec deuxième anticorps secondaire marqué fluorescent, dilué en 3% NGS en PBS, à température ambiante pendant une heure.Après cela laver les cellules trois fois avec PBS. Placez d’abord doucement les glissements de couverture, côté cellule vers le bas, sur 12 à 15 microlitres du support de montage approprié pour monter les cellules. Puis imagez les cellules sur le microscope confocal approprié, et analysez les cellules telles que décrites dans le protocole de texte.Ce protocole d’étude du trafic des récepteurs du glutamate est basé sur l’étiquetage différentiel des récepteurs, exprimés à la surface des cellules, et ceux exprimés dans les membranes internes. Après l’acquisition d’images confoccales, le signal fluorescent peut être facilement quantifié pour montrer une augmentation de l’expression de surface, par rapport à la population intracellulaire, suivant le LTP chimique. Aucun signal pour PSD-95 ne peut être obtenu dans les cellules non permeabilized, démontrant l’intégrité de la membrane de plasma.Cela indique que le signal obtenu pour la surface GluA1 correspond en effet aux récepteurs exprimés en surface. Fait important, un signal minimal pour le GluA1 intériorisé peut être observé dans des conditions de non-perméabilisation, montrant que tous les épitopes de surface sont occupés par la ronde initiale de l’étiquetage des anticorps. Les récepteurs intériorisés sont ensuite identifiés.Cet exemple souligne que la phosphorylation GluN2B à S1480 favorise l’internalisation des récepteurs. Comme le mutant phosphomimétique S1480E affichait un ratio d’internalisation beaucoup plus élevé par rapport aux récepteurs de type sauvage. Comme prévu, aucun signal n’est obtenu pour les récepteurs intériorisés dans le contrôle.Ensuite, des récepteurs recyclés et des récepteurs intériorisés sont identifiés. Le rapport de recyclage généré montre que GluN2B S1480E n’a aucun effet sur le recyclage NMDAR. Dans le contrôle, un signal fort peut être observé pour la surface exprimée GluN2B en l’absence de blocage Fab.Ce signal disparaît dans les cultures traitées par Fab, ce qui démontre que le protocole de blocage est suffisant pour bloquer complètement les épitopes exprimés en surface, et que les signaux de surface observés après recyclage correspondent en effet à des récepteurs trafiqués vers la membrane plasmatique. Le protocole actuel n’est qu’une des méthodes disponibles pour étudier la régulation des protéines exprimées en surface. D’autres approches peuvent être adoptées pour élargir ou vérifier les données obtenues ici.Il s’agit notamment de méthodes biochimiques, comme la biotinylation, les techniques d’imagerie de la vie, ou des approches fonctionnelles, comme l’électrophysiologie ou l’imagerie calcique. Nous utilisons pfa pour geler la localisation des récepteurs, mais PFA est un carcinogène connu, il est donc crucial d’effectuer des étapes en utilisant PFA sous un capot de fumée, tout en portant PPE approprié.

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Faible densité primaire hippocampique Neuron Culture

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Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...