Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

אנו מודים למרכז הצפון מערבי למיקרוסקופיה מתקדמת לשימוש במיקרוסקופ הconfocal של ניקון A1 ובעזרתם בתכנון ובניתוח הניסויים. מחקר זה נתמך על ידי כלאמים (T32GM008061) (א. מ. ג.), ו-NIA (R00AG041225) ומענק החוקר הצעיר NARSAD מן המוח & התנהגות המחקר הקרן (24133) (א. ס.-ג.).

העבודה הקשורה הכנה התרבות הראשית נבדקה ואושרה על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן (פרוטוקולIS00001151).
1. הכנה לפני תיוג
<ol><li>
הכנה ואחזקה של תרביות היפוקאמאל הראשי
	<ol>
<li>הכנת תרבויות היפוקמאל העיקרי בצפיפות של 150,000 תאים מצופה פולי-D-ליזין-מצופה (0.1 mg...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+(NMDA)+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+(AMPA)+Receptors+by+Posttranslational+Modifications.">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons.">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition:+Many+Regulators,+Many+Consequences.">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation.">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient.">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li><li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).</li></ol>

האינטראקציה בין תא לסביבתו (למשל, תקשורת עם תאים אחרים, תגובה לגירויים שונים וכו '), נשענת בכבדות על ביטוי נכון של קולטנים במשטח התא. התקנה המהירה והטובה ביותר של תוכן הקולטן לפני השטח מאפשרת תגובה תאית נאותה לסביבה שמשתנה ללא הרף. במקרה מסוים של נוירונים, שינויים במספר, לוקליזציה, והרכב יחי?...

תאים לנצל את התהליך הפעיל של סחר כדי לגייס חלבונים מסוימים לוקליזציה subcellular ולהפעיל רגולציה קפדנית הרקתית על הפונקציה שלהם1. תהליך זה חשוב במיוחד עבור קולטנים טרנסקרום, כמו תגובות הסלולר גירויים סביבתיים שונים להסתמך על מפלי תאיים המופעל על ידי הפעלת הקולטן. תאים מסוגלים לשנות את התגובות הללו על ידי שינוי צפיפות, לוקליזציה, והרכב יחידת של קולטנים הביע במשטח התא באמצעות הקולטן יחידת בתקנה הסחר2. החדרת קולטנים החדש מתחת לחומרים לתוך קרום הפלזמה, יחד עם אנדוקציטוזה ומיחזור של קולטנים קיימים הם דוגמאות של תהליכי סחר הקובעים את המאגר הנקי של המשטח הביע קולטנים2. מנגנונים מולקולריים רבים משתפים פעולה כדי לווסת את סחר החלבונים, כולל אינטראקציות חלבונים בחלבון ושינויים פוסט-מפלגתיים כגון זירחון, אוביקוויציה, או פלמיטלציה2.
התקנה של סחר בקולטן נדרש במיוחד תאים מקוטב מאוד עם מבנים מיוחדים מאוד. הדוגמה פרדיגמטי היא השליטה של פונקציה עצבית על ידי סחר מוסדר של קולטני גלוטמט (glurs)3,4. גלוטמט, נוירוטרנסמיטר הגירוי העיקרי, נקשר ומפעיל משטח הביע GluRs לשלוט פונקציות נוירואליות פיזיולוגית היסוד כגון המוח הנוירוטיות והפלסטיות הסינפטית. העובדה ששינוי סחר GluR נצפתה בספקטרום רחב של neuropathies, החל בהפרעות נוירותיות למחלות ניווניות, מדגיש את החשיבות של תהליך זה5. לפיכך, הבנת האירועים המולקולריים השולטים בסחר בגלואר הוא עניין בתחומים רבים של מחקר.
בפרוטוקול זה, האכלה נוגדן שיטה מבוססת משמש כדי לכמת את רמת הקרקע ביטא GluRs בנוירונים היפוקמאל העיקרי, כמו גם להעריך כיצד שינויים הפנמה ומיחזור תוצאה ביטוי נטו הנצפים השטח. השימוש פרמקולוגיה ו/או ביטוי יתר של קולטני אקסוגני מחסה מוטציות ספציפיות הופך פרוטוקול זה גישה רבת עוצמה במיוחד לחקר מנגנונים מולקולריים בבסיס הסתגלות עצבית לגירויים סביבתיים שונים. דוגמה אחרונה של כלי השירות של פרוטוקול זה היא לימוד כיצד שינויים רב-עצרת בסביבה (כגון מודלים של מחלות) משפיעים על סחר בסמים באמצעות בחינת ביטוי המשטח במודלים כאלה.
באמצעות דוגמאות ספציפיות, זה הוכיח בתחילה כיצד מניפולציה פרמקוקולוגי מחקה גירוי פיזיולוגי (ltp כימי (cltp)] מגביר את הביטוי פני השטח של GluA1 יחידת האנדוגניים של ה-אמסוגאס-סוג של glurs (ampars) 6. הסחר של הצורה המבוטאת בצורת פוספאו-מGluN2B של NMDA-סוג של GluRs (NMDARs) מנותח גם כדי להדגים כיצד פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את הרגולציה של סחר GluR על ידי מסוים מיקוד שינויים. למרות דוגמאות ספציפיות אלה משמשים, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מוחל על GluRs אחרים וקולטנים אחרים וחלבונים בעלי תחומים מורים אנטיגניים. במקרה שאין נוגדנים זמינים עבור תחומים מגלותוניים, ביטוי יתר של אפיוליותאופ-מתויג (למשל, דגל-, Myc-, GFP-tagged, וכו ') חלבונים יכולים לסייע בתיוג חלבונים.
הפרוטוקול הנוכחי מספק הוראות לכימות צפיפות מסוג מסוים של GluR וסחר באמצעות נוגדנים ספציפיים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ללמוד 1) הכולל משטח GluR ביטוי, 2) הפנמה GluR, ו 3) מיחזור GluR. כדי ללמוד כל תהליך בנפרד, מומלץ להתחיל בסעיפים 1 ו-2 ולהמשיך בסעיף 3, 4 או 5. בכל המקרים, סיים עם סעיפים 6 ו-8 (איור 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

התגובות הסלולר גירויים חיצוניים להסתמך בכבדות על הסט של קולטנים מבוטא במשטח התא ברגע נתון. בהתאם לכך, אוכלוסיית הקולטנים המתבטאת בפני השטח מסתגלת כל הזמן ובכפוף למנגנונים נוקשים של רגולציה. הדוגמה פרדיגמטי ואחד האירועים ביותר ללמד סחר בביולוגיה היא השליטה מוסדר של הביטוי הסינפטית של קולטני גלוטמט (GluRs). GluRs לתווך את הרוב המכריע של הגירוי הנוירולוגי במערכת העצבים המרכזית ושליטה על פעילות פיזיולוגית התלויים שינויים פונקציונליים ומבניים ברמות סינפטית ועצביים (למשל, הפלסטיות הסינפטית). שינויים במספר, מיקום, והרכב תת יחידת של פני השטח הביע GluRs להשפיע עמוקות על תפקוד עצבי, למעשה, שינויים בגורמים אלה קשורים neuropathies שונים. מוצג כאן הוא שיטה ללמוד סחר GluR בנוירונים היפוקמאל ההיפוסוייםהינתק. גישה "להאכלת נוגדנים" משמשת כדי להמחיש באופן מהותי אוכלוסיות GluR המתבטאים על פני השטח והקרומים הפנימיים. על ידי תיוג קולטני פני השטח על תאים חיים ותיקון אותם בזמנים שונים כדי לאפשר קולטנים endocyציטוזה ו/או מיחזור, תהליכים אלה סחר ניתן להעריך באופן סלקטיבי למד. זהו פרוטוקול רב-תכליתי שניתן להשתמש בו בשילוב עם גישות פרמקולוגית או ביטוי יתר של קולטנים משתנים כדי לקבל מידע חשוב על גירויים ומנגנונים מולקולריים המשפיעים על סחר בסמים. באופן דומה, זה יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד קולטנים אחרים או פני השטח הביעו חלבונים.

פרוטוקול זה כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט מבוסס על תיוג דיפרנציאלי של קולטנים ביטא על פני השטח התא ואלה ביטא ממברנות פנימיים. הפרדה מושגת על ידי תיוג הקולטנים לפני ואחרי החדירות הממברנה, באמצעות הנוגדן העיקרי אותו אבל נוגדן משני מצועם שונות fluorophore. כפי שמתואר בצעדים הא?...

Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.

גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

התגובות התאיות לגירויים חיצוניים מסתמכות במידה רבה על מערכת החלבונים המובעים על פני התא ברגע נתון. בהתאם לכך, המספר, לוקליזציה תת-תאית והרכב תת-אחדות של חלבונים אלה נשלטים באופן דינמי. כאן נשתמש בגישה של האכלת נוגדנים כדי לכמת את רמת הקולטנים המובעים בתרבות התאים, כל עוד ההפנמה והמיחזור מתחדשים.זהו פרוטוקול רב-תכליתי מאוד, המספק מידע מכני על ויסות חלבונים המובעים על פני השטח. בדוגמה שלנו, נלמד קולטני גלוטמין בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל חלבון בעל אפיטופ חוץ-תאי אנגני, אם נוגדנים אינם זמינים, טרנסווקציה של מבנים מתויגים יכולה להיות שימושית הן לתיוג והן ללימוד מוטציות ספציפיות.בדוגמאות שלנו, אנו משתמשים בנוגדנים נגד GluA1 אנדוגני, ו מתויג Glu12 B.To להתחיל בהליך זה, להעביר את הצד תא מחליק כיסוי עד מגש מכוסה סרט פרפין, כדי להציל את רייגנטים, להקל על מניפולציה. שמרו ותחזקו מדיה מותנה ב-37 מעלות צלזיוס לצורך דגירה וצעדי כביסה. הדגירה את התאים עם נוגדנים ראשוניים מדוללים במדיה מותנה, בטמפרטורת החדר, במשך 15 דקות.לאחר מכן, השתמש פיפטה ואקום כדי לשאוב בזהירות את הנוגדן המכיל מדיה, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיה מותנה. אם לימוד פני השטח לעומת ביטוי קולטן תאי לתקן את התאים עם paraformaldehyde לאחר שלב זה, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לשמור על התאים במדיה מותנה ללא נוגדנים, ולהחזיר אותם החממה ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר הפנמה.אם לומדים תהליך הפנמה, תקן את התאים בפרפורמלדהיד לאחר שלב זה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לחסום את האפיטופים על הנוגדן העיקרי המחובר לפני השטח הביעו קולטנים שלא הופנמו, דגירה תאים עם שברי נוגדנים Fab נגד IgG ללא תנאים מדוללים במדיה מותנה, במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיה מותנה.הדגירה בארות שטף עם מדיה מותנה המכיל 80 Dynasore micromolar, ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר מיחזור של קולטנים מופנמים. לאחר סיום השינויים בתאים חיים, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS פלוס. הוסיפו פתרון של 4%paraformaldehyde ו-4%sucrose ב-PBS לתאים, והדגירה במכסה המנוע של האדים בטמפרטורת החדר למשך שבע עד שמונה דקות, כדי לתקן את התאים.ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS רגיל. הוסף פתרון של 10%Normal Goat Serum ב- PBS לתאים, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, כדי לחסום אתרי איגוד לא ספציפיים. לאחר מכן, הדגירה את התאים עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי מדולל 3%NGS ב PBS בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, כדי לסמן קולטני תווית נוגדנים ראשוניים.לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. כדי להתחיל לתייג את הקולטנים תאיים, להוסיף פתרון של 0.25% TritonX ב PBS, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש עד 10 דקות, כדי לחלחל לתאים. לאחר מכן חסום עם 10% NGS בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.אם לומדים משטח לעומת סך הכל, דגירה התאים עם אותו נוגדן ראשוני בשימוש בעבר, מדולל עם 3% NGS ב PBS, בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, כדי לסמן את הקולטנים תאיים. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. תווית עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי שני, מדולל ב 3%NGS ב PBS, בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.לאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. ראשית בעדינות למקם את תלושי הכיסוי, בצד התא למטה, על 12 עד 15 microliters של מדיה הרכבה המתאימה כדי לטעון את התאים. לאחר מכן תדמיין את התאים במיקרוסקופ הקונפוקל המתאים, ותנתח את התאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.פרוטוקול זה לחקר סחר קולטני גלוטמט מבוסס על תיוג דיפרנציאלי של קולטנים, לידי ביטוי על פני התא, ואלה לידי ביטוי בקרום פנימי. לאחר רכישת תמונות קונפוקליות, ניתן לכמת בקלות את אות הפלואורסצנטי כדי להראות עלייה בביטוי פני השטח, יחסית לאוכלוסייה תאית, בעקבות LTP כימי. אין אות עבור PSD-95 ניתן להשיג בתאים שאינם מחלחלים, המדגים את השלמות של קרום הפלזמה.זה מציין כי האות המתקבל עבור פני השטח GluA1 אכן מתאים קולטנים מבוטא פני השטח. חשוב לציין, אות מינימלי עבור GluA1 הפנמה ניתן לצפות בתנאים שאינם permeabilization, מראה כי כל אפיטופים פני השטח מאוכלסים על ידי הסיבוב הראשוני של תיוג נוגדנים. קולטנים שהופנמו מזוהים לאחר מכן.דוגמה זו מדגישה כי זרחון GluN2B ב S1480 מקדם הפנמת קולטן. כמו מוטציה phosphomimetic S1480E הציג יחס הפנמה הרבה יותר גבוה בהשוואה לקולטנים מסוג בר. כצפוי, לא מתקבל אות לקולטנים פנימיים בפקד.לאחר מכן, קולטנים ממוחזרים קולטנים מופנמים מזוהים. יחס המיחזור שנוצר מראה כי GluN2B S1480E אין השפעה על מיחזור NMDAR. בשליטה, אות חזק ניתן לראות עבור פני השטח לידי ביטוי GluN2B בהיעדר חסימה Fab.אות זה נעלם בתרבויות שטופלו Fab, המוכיח כי פרוטוקול החסימה מספיק כדי לחסום לחלוטין את פני השטח לידי ביטוי epitopes, כי אותות פני השטח שנצפו לאחר מיחזור אכן תואמים קולטנים שנסחרו בחזרה קרום הפלזמה. הפרוטוקול הנוכחי הוא רק אחת השיטות הזמינות לחקר הרגולציה של חלבונים מבוטאים פני השטח. ניתן לנקוט בגישות אחרות כדי להרחיב או לאמת את הנתונים המתקבלים כאן.אלה כוללים שיטות ביוכימיות, כמו ביוטינילציה, טכניקות הדמיה חיים, או גישות פונקציונליות, כמו אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה סידן. אנו משתמשים PFA כדי להקפיא את הלוקליזציה של קולטנים, אולם PFA הוא מסרטן ידוע, ולכן זה חיוני כדי לבצע צעדים באמצעות PFA תחת מכסה המנוע אדים, תוך לבישת PPE המתאים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...