Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
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Ringraziamo il Northwestern Center for Advanced Scopy per l'uso del microscopio Nikon A1 Confocal e la loro assistenza nella pianificazione e nell'analisi degli esperimenti. Questa ricerca è stata supportata da NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e da un NARSAD Young Investigator Grant della Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).

Il lavoro per la preparazione della cultura primaria dell'ippocampo è stato esaminato e approvato dal Northwestern University Animal Care and Use Committee (protocollo #IS00001151).
1. Preparazione prima dell'etichettatura
<ol><li>
Preparazione e manutenzione delle colture primarie dell'ippocampo
	<ol>
<li>Preparare colture primarie di ippocampali ad una densità di 150.000 cellule placcate su bicchieri di copertura rivestiti in poli-D-lysina (0,1 mg/mL). Eccellenti guide p...

<ol>
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L'interazione tra una cellula e il suo ambiente (ad esempio, la comunicazione con altre cellule, la risposta a diversi stimoli, ecc.), si basa fortemente sulla corretta espressione dei recettori sulla superficie cellulare. La regolazione rapida e messa a punto nel contenuto del recettore espresso in superficie consente una risposta cellulare adeguata a un ambiente in continua evoluzione. Nel caso particolare dei neuroni, le alterazioni del numero, la localizzazione e la composizione delle sottounità di recettori sinatic...

Le cellule utilizzano il processo attivo di traffico per mobilitare le proteine a specifiche localizzazioni subcellulari ed esercitare una rigorosa regolazione spatiotemporale sulla loro funzione1. Questo processo è particolarmente importante per i recettori transmembrani, poiché le risposte cellulari a diversi stimoli ambientali si basano su cascate intracellulari innescate dall'attivazione del recettore. Le cellule sono in grado di modificare queste risposte alterando la densità, la localizzazione e la composizione delle sottounità dei recettori espressi sulla superficie cellulare tramite il regolamento del traffico subcellulare del recettore2 . L'inserimento di nuovi recettori sintetizzati nella membrana plasmatica, insieme all'endocitosi e al riciclaggio dei recettori esistenti sono esempi di processi di traffico che determinano il pool netto di recettori espressi in superficie2. Molti meccanismi molecolari cooperano per regolare il traffico di proteine, comprese le interazioni proteina-proteina e le modifiche post-traduzionali come il fosforo, l'ubiquitinazione o il palmitoylation2.
La regolazione del traffico dei recettori è particolarmente necessaria in cellule fortemente polarizzate con strutture altamente specializzate. L'esempio paradigmatico è il controllo della funzione neuronale mediante traffico regolato di recettori del glutammato (GluR)3,4. Glutamate, il principale neurotrasmettitore eccitatorio, lega e attiva GluR espressi in superficie per controllare le funzioni neuronali fisiologiche fondamentali come la neurotrasmissione sinaptica e la plasticità sinaptica. Il fatto che il traffico alterato di GluR sia stato osservato in un ampio spettro di neuropatie, che vanno dai disturbi del neurosviluppo alle malattie neurodegenerative, evidenzia l'importanza di questo processo5. Pertanto, comprendere gli eventi molecolari che controllano il traffico di GluR è di interesse in molte aree di ricerca.
In questo protocollo, viene utilizzato un metodo basato sull'alimentazione degli anticorpi per quantificare il livello di GluR espressi in superficie nei neuroni ippocampali primari, nonché per valutare come i cambiamenti nell'internalizzazione e nel riciclo si traducano nell'espressione della superficie netta osservata. L'uso di farmacologia e/o sovraespressione di recettori esogeni che ospitano mutazioni specifiche rende questo protocollo un approccio particolarmente potente per studiare i meccanismi molecolari alla base dell'adattamento neuronale a diversi stimoli ambientali. Un ultimo esempio dell'utilità di questo protocollo è lo studio di come i cambiamenti multifattoriali nell'ambiente (come in un modello di malattia) influenzino il traffico di GluR attraverso l'esame dell'espressione superficiale in tali modelli.
Utilizzando esempi specifici, è inizialmente dimostrato come una manipolazione farmacologica che imita la stimolazione sinaptica fisiologica [LTP chimico (cLTP)] aumenti l'espressione superficiale della sottounità endogena GluA1 del tipo AMPA dei GluR (AMPAR) 6.Il traffico di una forma fosforo-mimetica sovraespressa della sottounità GluN2B di NLUDA-tipo di GluRs (NMDAR) viene analizzato anche per esemplificare come questo protocollo può essere utilizzato per studiare la regolazione del traffico di GluR da parte di specifiche post-traslazionali Modifiche. Anche se questi esempi specifici sono utilizzati, questo protocollo può essere facilmente applicato ad altri GluR e altri recettori e proteine che possiedono domini extracellulari antigenici. Nel caso in cui non siano disponibili anticorpi per i domini extracellulari, la sovraespressione delle proteine con etichettatura epitope extracellulare (ad esempio, Flag-, Myc-, GFP-tagged, ecc.) può aiutare nell'etichettatura delle proteine.
L'attuale protocollo fornisce istruzioni per quantificare la densità e il traffico specifici di sottotipi di GluR utilizzando anticorpi specifici. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare 1) espressione di superficie GluR totale, 2) internalizzazione GluR e 3) riciclaggio di GluR. Per studiare ogni processo singolarmente, si consiglia di iniziare con le sezioni 1 e 2 e continuare con le sezioni 3, 4 o 5. In tutti i casi, terminare con le sezioni 6 e 8 (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Le risposte cellulari agli stimoli esterni si basano fortemente sull'insieme di recettori espressi sulla superficie cellulare in un dato momento. Di conseguenza, la popolazione di recettori espressi in superficie è costantemente adattandosi e soggetta a rigidi meccanismi di regolazione. L'esempio paradigmatico e uno degli eventi di traffico più studiati in biologia è il controllo regolato dell'espressione sinaptica dei recettori del glutammato (GluRs). I GluR mediano la stragrande maggioranza della neurotrasmissione eccitatoria nel sistema nervoso centrale e controllano i cambiamenti funzionali e strutturali dipendenti dall'attività fisiologica a livello sinaptico e neuronale (ad esempio, plasticità sinaptica). Le modifiche nel numero, posizione, e la composizione delle sottounità di superficie espressi GluRs influenzano profondamente la funzione neuronale e, infatti, le alterazioni in questi fattori sono associate a diverse neuropatie. Presentato qui è un metodo per studiare il traffico di GluR nei neuroni primari ippocampali dissociati. Un approccio di "alimentazione anticorpale" viene utilizzato per visualizzare in modo differenziale le popolazioni di GluR espresse nelle membrane superficiali e interne. Etichettando i recettori di superficie sulle cellule vive e fissandoli in momenti diversi per consentire l'endocitosi e/o il riciclaggio dei recettori, questi processi di traffico possono essere valutati e studiati in modo selettivo. Questo è un protocollo versatile che può essere utilizzato in combinazione con approcci farmacologici o sovraespressione di recettori alterati per ottenere informazioni preziose sugli stimoli e sui meccanismi molecolari che influenzano il traffico di GluR. Allo stesso modo, può essere facilmente adattato per studiare altri recettori o proteine espresse dalla superficie.

Questo protocollo per studiare il traffico dei recettori del glutammato si basa sull'etichettatura differenziale dei recettori espressi sulla superficie cellulare e su quelli espressi nelle membrane interne. La segregazione si ottiene etichettando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo diverso. Come delineato dalle fasi facoltative incluse il protocollo, questo è un metod...

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An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l'identificazione di meccanismi molecolari che regolano l'espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Le risposte cellulari agli stimoli esterni si basano fortemente sull'insieme di proteine che si esprimono sulla superficie cellulare in un dato momento. Di conseguenza, il numero, la localizzazione subcellulare e la composizione subunità di queste proteine sono controllati dinamicamente. Qui, useremo un approccio di alimentazione degli anticorpi per quantificare il livello di recettori espressi in superficie nelle colture cellulari, purché riprenda l'internalizzazione e il riciclaggio.Si tratta di un protocollo molto versatile, che fornisce informazioni meccaniche sulla regolazione delle proteine espresse in superficie. Nel nostro esempio, studieremo i recettori della glutammina nei neuroni ippocampali primari. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi proteina che possiede un epitopo extracellulare anagenico, se gli anticorpi non sono disponibili, la trasvezione di costrutti taggati può essere utile sia per l'etichettatura che per lo studio di mutazioni specifiche.Nei nostri esempi, usiamo anticorpi contro il GluA1 endogeno, e taggato Glu12 B.To iniziamo questa procedura, trasferiamo il lato cellulare della copertura fino a un vassoio coperto di pellicola di paraffina, per salvare i reagenti e facilitare la manipolazione. Salvare e mantenere i supporti condizionati a 37 gradi Celsius per le fasi di incubazione e lavaggio. Incubare le cellule con anticorpi primari diluiti in mezzi condizionati, a temperatura ambiente, per 15 minuti.Successivamente, utilizzare una pipetta sottovuoto per aspirare con cura l'anticorpo contenente mezzi e lavare le cellule tre volte con mezzi condizionati. Se si studia l'espressione del recettore della superficie rispetto a quella intracellulare, fissare le cellule con paraformaldeide dopo questo passaggio, come delineato nel protocollo di testo. Mantenere le cellule in mezzi condizionati senza anticorpi e restituirle all'incubatrice a 37 gradi Celsius per consentire l'internalizzazione.Se si studia il processo di internalizzazione, correggere le celle con paraformaldeide dopo questo passaggio, come indicato nel protocollo di testo. Per bloccare gli epitopi sull'anticorpo primario attaccato alla superficie espresso recettori che non sono stati internalizzati, incubare cellule con frammenti anticorpali Fab anti-IgG non coniugati diluiti in mezzi condizionati, per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo questo, lavare le cellule tre volte con mezzi condizionati.Incubare i pozzi lavati con mezzi condizionati contenenti 80 micromolare Dynasore, a 37 gradi Celsius, per consentire il riciclo dei recettori internalizzati. Dopo aver terminato le modifiche sulle cellule vive, lavare le cellule una volta con PBS plus. Aggiungere alle cellule una soluzione di paraformaldeide e 4% di saccarosio in PBS e incubare in una cappa aspirante a temperatura ambiente per sette-otto minuti, per fissare le cellule.Quindi lavare le cellule tre volte con PBS normale. Aggiungere una soluzione di siero di capra normale al 10% in PBS alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per bloccare siti di legame non specifici. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi secondari contrassegnati fluorescentmente diluiti in 3%NGS in PBS a temperatura ambiente per un'ora, per etichettare i recettori delle etichette degli anticorpi primari.Dopo questo, lavare le cellule tre volte con PBS. Per iniziare a etichettare i recettori intracellulari, aggiungere una soluzione dello 0,25%TritonX in PBS e incubare a temperatura ambiente per cinque-10 minuti, per permeabilizzare le cellule. Quindi blocca con 10%NGS a temperatura ambiente per 30 minuti.Se si studiano superficie rispetto al totale, incubare le cellule con lo stesso anticorpo primario utilizzato in precedenza, diluite con 3%NGS in PBS, a temperatura ambiente per un'ora, per etichettare i recettori intracellulari. Quindi, lavare le cellule tre volte con PBS. Etichetta con secondo anticorpo secondario contrassegnato fluorescentmente, diluito in 3%NGS in PBS, a temperatura ambiente per un'ora.Dopo questo lavare le cellule tre volte con PBS. Posizionare prima delicatamente i coperchi, lato cella verso il basso, su 12-15 microlitri del supporto di montaggio appropriato per montare le celle. Quindi immagini le celle sul microscopio confocale appropriato e analizza le celle come delineato nel protocollo di testo.Questo protocollo per studiare il traffico del recettore del glutammato si basa sull'etichettatura differenziale dei recettori, espressa sulla superficie cellulare, e di quelli espressi nelle membrane interne. Dopo aver acquisito immagini confocali, il segnale fluorescente può essere facilmente quantificato per mostrare un aumento dell'espressione superficiale, rispetto alla popolazione intracellulare, a seguito di LTP chimico. Nessun segnale per PSD-95 può essere ottenuto in cellule non permeabilizzate, dimostrando l'integrità della membrana plasmatica.Ciò indica che il segnale ottenuto per la superficie GluA1 corrisponde effettivamente ai recettori espressi in superficie. È importante sottolineare che un segnale minimo per il GluA1 interiorizzato può essere osservato in condizioni di non permeabilizzazione, dimostrando che tutti gli epitopi superficiali sono occupati dal ciclo iniziale di etichettatura degli anticorpi. Vengono quindi identificati i recettori che sono stati internalizzati.Questo esempio evidenzia che la fosforilazione GluN2B a S1480 promuove l'internalizzazione del recettore. Poiché il mutante fosfomimetico S1480E mostrava un rapporto di internalizzazione molto più elevato rispetto ai recettori di tipo selvaggio. Come previsto, non viene ottenuto alcun segnale per i recettori internalizzati nel controllo.Successivamente, vengono identificati recettori riciclati e recettori internalizzati. Il rapporto di riciclaggio generato mostra che GluN2B S1480E non ha alcun effetto sul riciclaggio NMDAR. Nel controllo, un segnale forte può essere osservato per la superficie espressa GluN2B in assenza di blocco Fab.Questo segnale scompare nelle colture trattate da Fab, dimostrando che il protocollo di blocco è sufficiente per bloccare completamente gli epitopi espressi in superficie, e che i segnali superficiali osservati dopo il riciclaggio corrispondono effettivamente ai recettori trafficati verso la membrana plasmatica. L'attuale protocollo è solo uno dei metodi disponibili per studiare la regolazione delle proteine espresse in superficie. Altri approcci possono essere adottati per espandere o verificare i dati ottenuti qui.Questi includono metodi biochimici, come la biotinylation, le tecniche di imaging della vita o approcci funzionali, come l'elettrofisiologia o l'imaging del calcio. Usiamo pfa per congelare la localizzazione dei recettori, tuttavia PFA è un noto cancerogeno, quindi è fondamentale eseguire passaggi utilizzando PFA sotto una cappa aspirante, mentre si indossano DPI appropriati.

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Stripe Assay per studiare l&#39;attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell&#39;ippocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...