Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
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我々は、ニコンA1共焦点顕微鏡の使用と実験の計画と分析における彼らの支援のためのノースウェスタン先端顕微鏡センターに感謝します。本研究は、NIGMS(T32GM008061)(A.M.C.)、NIA(R00AG041225)、および脳行動研究財団(#24133)のNARSAD若手研究者助成金(A. S.

海馬一次培養に関する研究は、ノースウェスタン大学動物ケア・使用委員会(プロトコル#IS00001151)によって検討され、承認されました。
1. ラベリング前の準備
<ol><li>
一次海馬培養の準備と維持
	<ol>
<li>ポリD-リジンコーティング(0.1 mg/mL)18mmカバーメガネでメッキされた150,000個の細胞の密度で一次海馬培養物を調製します。解離された神経培養製剤のための優...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. 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細胞とその環境との相互作用(例えば、他の細胞との通信、異なる刺激への応答など)は、細胞表面における受容体の正しい発現に大きく依存する。表面発現受容体含有量の迅速かつ微調整された調節は絶えず変化する環境への適切な細胞応答を可能にする。ニューロンの特定のケースでは、シナプス発現受容体の数、局在化、およびサブユニット組成の変化は、シナプス伝達、シナプス可塑?...

細胞は、特定の細胞内局在度にタンパク質を動員し、その機能1に対して厳格な時空間調節を行うために、人身売買のアクティブなプロセスを利用する。異なる環境刺激に対する細胞応答は、受容体活性化によって引き起こされる細胞内カスケードに依存するように、このプロセスは、膜受容体にとって特に重要です。細胞は、受容体細胞内取引調節規則2を介して細胞表面で発現される受容体の密度、局在化、およびサブユニット組成を変化させることによって、これらの応答を修飾することができる。新たに合成された受容体を血漿膜に挿入し、既存の受容体のエンドサイトーシスおよびリサイクルと共に、表面発現受容体2のネットプールを決定する人身売買プロセスの例である。多くの分子機構は、タンパク質とタンパク質の相互作用やリン酸化、ユビキキテーション、またはパルミトイル化2などの翻訳後修飾を含むタンパク質の密売を調節するために協力する。
受容体の人身売買の調節は、高度に特殊化された構造を有する強い偏分細胞において特に必要とされる。パラダイムの例は、グルタミン酸受容体(GluR)3、4の規制された人身売買による神経機能の制御である。グルタミン酸は、主な興奮性神経伝達物質であり、シナプス神経伝達およびシナプス可塑性などの基本的な生理的神経機能を制御するために表面発現GluRを結合し、活性化する。変化したGluR人身売買が神経発達障害から神経変性疾患に至るまで、神経障害の広いスペクトルで観察されているという事実は、このプロセス5の重要性を強調している。したがって、GluRの人身売買を制御する分子事象を理解することは、研究の多くの分野で興味深い。
このプロトコルでは、抗体供給ベースの方法を使用して、一次海馬ニューロンにおける表面発現GLURのレベルを定量化し、内部化およびリサイクルの変化が観察された正味表面発現にどのように生じるかを評価する。特定の変異を持つ外因性受容体の薬理学および/または過剰発現の使用は、このプロトコルが異なる環境刺激に対するニューロン適応の基礎となる分子メカニズムを研究するための特に強力なアプローチになります。このプロトコルの有用性の最終的な例は、このようなモデルにおける表面発現の検査を通じて、環境の多因子変化(疾患モデルなど)がGluRの人身売買にどのように影響するかを調べている。
具体的な例を用いて、生理シナプス刺激を模倣する薬理学的操作[化学LTP(cLTP)]がAMPA型GluR(AMPA)の内因性GluA1サブユニットの表面発現を増加させる方法を最初に実証する。6.NMDA型GluR(NMA)のGluN2Bサブユニットの過剰発現リン模倣形態の人身売買も分析され、このプロトコルが特定の翻訳後のGluR人身売買の規制を研究するためにどのように使用できるかを示す。変更。これらの特定の例が使用されるが、このプロトコルは、抗原細胞外ドメインを有する他のGluRおよび他の受容体およびタンパク質に容易に適用することができる。細胞外ドメインに利用可能な抗体がない場合、細胞外エピトープタグ付き(例えば、フラグ、Myc-、GFPタグなど)タンパク質の過剰発現は、タンパク質標識を助けることができる。
現在のプロトコルは、特定のGluRサブタイプ密度を定量し、特定の抗体を使用して人身売買を行うための指示を提供する。このプロトコルは、1)総GluR表面発現、2)GluR内部化、および3)GluRリサイクルを研究するために利用することができる。各プロセスを個別に学習するには、セクション 1 と 2 から始め、セクション 3、4、または 5 のいずれかに進むことをお勧めします。いずれの場合も、セクション 6 と 8 (図1) で終了します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

外部刺激に対する細胞応答は、所定の瞬間に細胞表面で発現される受容体のセットに大きく依存する。したがって、表面発現受容体の集団は常に適応し、規制の厳格なメカニズムに従います。パラダイムの例と生物学で最も研究された人身売買イベントの一つは、グルタミン酸受容体(GluR)のシナプス発現の調節制御です。GluRsは、中枢神経系における興奮性神経伝達の大部分を媒介し、シナプスおよび神経レベル(例えば、シナプス可塑性)における生理活性依存的機能的および構造的変化を制御する。GLURを発現した表面の数、位置、およびサブユニット組成の変化は、神経機能に深く影響を及ぼし、実際には、これらの因子の変化は異なる神経因果関係に関連している。ここで提示される解離海馬原発性ニューロンにおけるGluR人身売買を研究する方法である。「抗体供給」アプローチは、表面および内部膜で発現されるGluR集団を差別的に可視化するために使用される。生細胞に表面受容体を標識し、異なる時間に固定して受容体のエンドサイトシスおよび/またはリサイクルを可能にすることで、これらの人身売買プロセスを評価し、選択的に研究することができます。これは、GluRの人身売買に影響を与える刺激および分子メカニズムに関する貴重な情報を得るために、薬理学的アプローチまたは改変された受容体の過剰発現と組み合わせて使用することができる汎用性の高いプロトコルです。同様に、他の受容体または表面発現タンパク質を研究するために容易に適合させることができる。

グルタミン酸受容体の密売を研究するこのプロトコルは、細胞表面で発現される受容体と内部膜で発現される受容体の差分標識に基づいている。分離は、膜透過前後の受容体を標識することによって達成され、同じ一次抗体を用いて、異なるフルオロフォアに結合した二次抗体を用いる。プロトコルを含むオプションの手順で概説されているように、これは内部化や?...

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An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

この記事では、解離された一次海馬培養におけるグルタミン酸受容体(GluR)の人身売買を研究する方法を紹介する。この方法は、内因性または過剰発現受容体を薬理学的アプローチと組み合わせて標識する抗体供給アプローチを用いて、変調によってGluR表面発現を調節する分子機構の同定を可能にする。内部化またはリサイクルプロセス。

解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

外部刺激に対する細胞応答は、所定の瞬間に細胞表面上で発現されるタンパク質のセットに大きく依存します。したがって、その数、細胞内局在化、およびこれらのタンパク質のサブユニット組成は動的に制御される。ここでは、細胞培養における表面発現受容体のレベルを定量化する抗体供給アプローチを用い、内在化およびリサイクル再開を行う限り行う。これは、表面発現タンパク質の調節の機械化情報を提供する非常に汎用性の高いプロトコルです。この例では、一次海馬ニューロンにおけるグルタミン受容体を研究します。このプロトコルは、アナジェニック細胞外エピトープを有するタンパク質に適合することができ、抗体が利用できない場合、タグ付き構築物のトランスベクションは、特定の突然変異の標識および研究の両方に有用であり得る。我々の例では、内因性GluA1に対する抗体を使用し、タグ付きGlu12は、この手順を開始B.To、パラフィンフィルムカバートレイまでカバースリップセル側を転送し、試薬を保存し、操作を容易にします。インキュベーションと洗浄のステップのために摂氏37度で調整された媒体を保存し、維持する。条件培地で希釈した一次抗体を、室温で15分間インキュベートします。この後、真空ピペットを使用して、培地を含む抗体を慎重に吸引し、細胞を調整された培地で3回洗浄します。表面対細胞内受容体発現を研究する場合、テキストプロトコルで概説したように、このステップの後にパラホルムアルデヒドで細胞を固定する。抗体を含まない状態の培地で細胞を維持し、37°Cでインキュベーターに戻して、内在化を可能にします。内在化プロセスを研究する場合は、テキストプロトコルで概説されているように、このステップの後にパラホルムアルデヒドで細胞を固定します。表面に結合した一次抗体上のエピトープを遮断し、インターナライズされていない受容体を発現し、コンジュゲートされていないFab抗IgG抗体断片をコンジュゲートした状態で培養し、コンディションされた培地で希釈し、室温で20分間培養する。この後、条件を付けた培地で細胞を3回洗います。洗浄されたウェルを、摂氏37度で80マイクロモルダイナソーレを含むコンディションされた培地でインキュベートし、内在型受容体のリサイクルを可能にする。生細胞の変更を終えた後、PBSプラスで細胞を一度洗います。4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースの溶液をPBSに加え、室温で7〜8分間ヒュームフードでインキュベートし、細胞を固定します。その後、通常のPBSで細胞を3回洗浄します。PBSに10%正常ヤギ血清の溶液を加え、室温で30分間インキュベートし、非特異的結合部位を遮断する。次に、PBSで3%NGSで蛍光タグ付き二次抗体を1時間室温で希釈して細胞をインキュベートし、一次抗体標識受容体を標識する。この後、細胞をPBSで3回洗浄する。細胞内受容体の標識を開始するには、PBSに0.25%TritonXの溶液を加え、室温で5〜10分間インキュベートし、細胞を透過させる。その後、室温で10%NGSで30分間ブロックします。表面対合計を研究する場合、細胞内の細胞を、以前に使用した同じ一次抗体で、PBSで3%NGSで希釈し、室温で1時間、細胞内受容体に標識する。次に、細胞をPBSで3回洗浄する。2番目の蛍光タグ付き二次抗体を用いた標識は、PBSで3%NGSで希釈し、室温で1時間希釈した。この後、細胞をPBSで3回洗浄する。まず、カバースリップをセル側に、適切な取り付け媒体の12~15マイクロリットルにそっと置いて、セルを取り付けます。次に、適切な共焦点顕微鏡上の細胞を画像化し、テキストプロトコルに概説されているように細胞を分析します。グルタミン酸受容体の密売を研究するこのプロトコルは、細胞表面で発現する受容体の差動標識に基づいて、および内部膜で発現するものである。共焦点画像を取得した後、蛍光シグナルを容易に定量することができ、細胞内集団に対して、化学的LTPに続く表面発現の増加を示すことができる。PSD-95のシグナルは、非透過細胞では得られないので、形質膜の完全性を示す。これは、表面GluA1について得られたシグナルが実際に表面発現受容体に対応することを示す。重要なことに、非パーメアビライゼーション条件下で、非透過型GluA1の最小シグナルを観察することができ、すべての表面エピトープが抗体標識の最初のラウンドによって占められていることを示す。その後、内在化された受容体が同定される。この例示は、S1480におけるGluN2Bリン酸化が受容体内在化を促進することを強調する。ホスホマイム変異体S1480Eとしては、野生型受容体と比較してはるかに高い内在化比を示した。予想通り、コントロール内の内在型受容体に対するシグナルは得られない。次に、再生受容体と内在型受容体が同定される。生成されたリサイクル比は、GluN2B S1480EがNMDARリサイクルに影響を与えがないことを示しています。制御では、Fabブロッキングがない場合にGluN2Bを発現した表面に対して強いシグナルを観察することができる。このシグナルはFab処理培養で消失し、ブロックプロトコルが表層を完全に遮断するのに十分であり、リサイクル後に観測された表面信号が実際に形質膜に戻って人身売買された受容体に対応していることを示している。現在のプロトコルは、表面発現タンパク質の調節を研究するために利用可能な方法の1つに過ぎません。ここで取得したデータを拡張または検証するには、他の方法を使用します。これらには、生化学的方法、バイオチン化、生命イメージング技術、または電気生理学またはカルシウムイメージングのような機能的アプローチが含まれる。PFAを使用して受容体の局在を凍結しますが、PFAは既知の発がん性物質であるため、適切なPPEを着用しながら、ヒュームフードの下でPFAを使用してステップを実行することが重要です。

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