Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

Vi takker Northwestern Center for Advanced mikroskopi for bruk av Nikon a1 Konfokalmikroskopi mikroskop og deres bistand i planlegging og analyse av eksperimenter. Denne forskningen ble støttet av NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), og NIA (R00AG041225) og en NARSAD unge etterforsker Grant fra Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Arbeidet knyttet til hippocampus primære kultur forberedelser ble gjennomgått og godkjent av Northwestern University Animal Care og use Committee (protokoll #IS00001151).
1. forberedelse før merking
<ol><li>
Forberedelse og vedlikehold av primære hippocampus kulturer
	<ol>
<li>Forbered primære hippocampus kulturer i en tetthet på 150 000 celler belagt på Poly-D-lysin-belagt (0,1 mg/mL) 18 mm deksel briller. Excellent guider for dissosiert neuronal kultur forberedelser...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+(NMDA)+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+(AMPA)+Receptors+by+Posttranslational+Modifications.">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons.">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition:+Many+Regulators,+Many+Consequences.">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation.">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient.">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li><li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).</li></ol>

Samspillet mellom en celle og dens miljø (f. eks, kommunikasjon med andre celler, respons på ulike stimuli, etc.), tungt avhengig av riktig uttrykk for reseptorer på celleoverflaten. Den raske og finjusterte reguleringen i overflate-uttrykt reseptor innhold muliggjør riktig cellulær respons på et stadig skiftende miljø. I det spesielle tilfelle av neurons, endringer i antall, lokalisering, og delenhet sammensetning av synaptically uttrykt reseptorer sterkt påvirkninger Synaptic kommunikasjon, Synaptic plastisitet...

Celler utnytte den aktive prosessen med menneskehandel å mobilisere proteiner til bestemte subcellulære lokaliseringer og utøve streng spatiotemporal regulering over deres funksjon1. Denne prosessen er spesielt viktig for transmembrane reseptorer, som cellulære svar på ulike miljømessige stimuli stole på intracellulære kaskader utløst av reseptor aktivering. Celler er i stand til å endre disse svarene ved å endre tettheten, lokalisering, og delenhet sammensetning av reseptorer uttrykt på celleoverflaten via reseptor subcellulære smugling regulering2. Innsetting av nylig synthetized reseptorer i plasma membranen, sammen med endocytose og resirkulering av eksisterende reseptorer er eksempler på menneskehandel prosesser som bestemmer netto pool av overflate-uttrykt reseptorer2. Mange molekylære mekanismer samarbeider for å regulere protein smugling, inkludert protein-protein interaksjoner og posttranslational modifikasjoner som fosforylering, ubiqitinering, eller palmitoylation2.
Regulering av reseptor smugling er spesielt nødvendig i sterkt polarisert celler med høyt spesialiserte strukturer. Paradigmatiske eksempel er kontroll av neuronal funksjon av regulert smugling av glutamat reseptorer (GluRs)3,4. Glutamat, den viktigste eksitatoriske signalstoff, binder og aktiverer overflate-uttrykt GluRs å kontrollere fundamentale fysiologiske neuronal funksjoner som Synaptic neurotransmission og Synaptic plastisitet. Det faktum at endret GluR smugling har blitt observert i et bredt spekter av nevropatier, alt fra neurodevelopmental lidelser til nevrodegenerative sykdommer, fremhever viktigheten av denne prosessen5. Dermed forstå den molekylære hendelser som kontrollerer GluR smugling er av interesse i mange områder av forskningen.
I denne protokollen brukes et antistoff-basert metode for å kvantifisere nivået av overflaten-uttrykt GluRs i primære hippocampus neurons samt vurdere hvordan endringer i internalisering og resirkulering resultere i observert netto overflate uttrykk. Bruk av farmakologi og/eller overuttrykte av eksogene reseptorer harboring spesifikke mutasjoner gjør denne protokollen en spesielt kraftfull tilnærming for å studere molekylære mekanismer underliggende neuronal tilpasning til ulike miljømessige stimuli. Et siste eksempel på nytten av denne protokollen er å studere hvordan multifaktoriell endringer i miljøet (for eksempel i en sykdom modeller) påvirker GluR smugling gjennom undersøkelse av overflate uttrykk i slike modeller.
Ved hjelp av konkrete eksempler, er det i utgangspunktet demonstrert hvordan en Pharmacologic manipulasjon etterligne fysiologiske Synaptic stimulering [kjemiske LTP (cLTP)] øker overflaten uttrykk for den endogene GluA1 delenhet av AMPA-type GluRs (AMPARs) 6. smugling av en overexpressed fosfat-mimetisk form av GluN2B delenhet av NMDA-type GluRs (NMDARs) er også analysert for å eksempler på hvordan denne protokollen kan brukes til å studere regulering av GluR smugling av bestemte posttranslational Endringer. Selv om disse konkrete eksemplene brukes, kan denne protokollen enkelt brukes på andre GluRs og andre reseptorer og proteiner som besitter antigen ekstracellulære domener. I tilfelle at det ikke er antistoffer tilgjengelig for ekstracellulære domener, overuttrykte av ekstracellulære epitope-merket (for eksempel Flag-, myC-, GFP-Tagged, etc.) proteiner kan bistå i protein merking.
Den gjeldende protokollen gir instruksjoner for kvantifisere spesifikk GluR under type tetthet og smugling ved hjelp av spesifikke antistoffer. Denne protokollen kan benyttes til å studere 1) totalt GluR overflate uttrykk, 2) GluR internalisering, og 3) GluR resirkulering. For å studere hver enkelt prosess individuelt, anbefales det å begynne med avsnitt 1 og 2 og fortsette med enten del 3, 4 eller 5. I alle tilfeller, avslutt med avsnittene 6 og 8 (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Cellular svar på eksterne stimuli tungt stole på settet av reseptorer uttrykt på celleoverflaten på et gitt tidspunkt. Følgelig er befolkningen i overflaten-uttrykt reseptorer stadig tilpasning og underlagt strenge mekanismer for regulering. Paradigmatiske eksempel og en av de mest studerte menneskehandel hendelser i biologi er regulert kontroll av Synaptic uttrykk for glutamat reseptorer (GluRs). GluRs megle det store flertallet av eksitatoriske neurotransmission i sentralnervesystemet og kontrollere fysiologiske aktivitets avhengige funksjonelle og strukturelle endringer på Synaptic og neuronal nivåer (f. eks Synaptic plastisitet). Modifikasjoner i antall, plassering, og delenhet sammensetning av overflaten uttrykt GluRs dypt påvirke neuronal funksjon og, faktisk, endringer i disse faktorene er forbundet med ulike nevropatier. Presentert her er en metode for å studere GluR smugling i dissosiert hippocampus primære neurons. En "antistoff-fôring" tilnærming brukes til å differensielt visualisere GluR populasjoner uttrykt på overflaten og interne membraner. Ved å merke overflaten reseptorer på levende celler og fikse dem på ulike tidspunkter for å tillate reseptorer endocytose og/eller resirkulering, disse menneskehandel prosesser kan evalueres og selektivt studert. Dette er en allsidig protokoll som kan brukes i kombinasjon med farmakologiske tilnærminger eller overuttrykte av endrede reseptorer for å få verdifull informasjon om stimuli og molekylære mekanismer som påvirker GluR smugling. På samme måte kan det lett tilpasses til å studere andre reseptorer eller overflate uttrykt proteiner.

Denne protokollen for å studere glutamat reseptor smugling er basert på differensial merking av reseptorer uttrykt på celleoverflaten og de uttrykt i interne membraner. Segregering oppnås ved merking av reseptorer før og etter membran permeabilization, ved hjelp av samme primære antistoff men en sekundær antistoff bøyd til en annen fluoroforen. Som skissert av den valgfrie fremgangsmåten inkludert protokollen, er dette en svært allsidig metode for forhører ulike reseptor mennes...

Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Denne artikkelen presenterer en metode for å studere glutamat reseptor (GluR) smugling i dissosiert primære hippocampus kulturer. Ved hjelp av en antistoff-fôring tilnærming til etiketten endogene eller overexpressed reseptorer i kombinasjon med farmakologiske tilnærminger, gjør denne metoden for identifisering av molekylære mekanismer som regulerer GluR overflate uttrykk ved modulerende internalisering eller resirkulerings prosesser.

Et antistoff fôring tilnærming til studier glutamat reseptor smugling i dissosiert primær hippocampus kulturer

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Cellulære responser på ytre stimuli er sterkt avhengige av settet med proteiner som uttrykkes på celleoverflaten i et gitt øyeblikk. Ifølge, antall, sub-cellulær lokalisering, og underenhet sammensetningen av disse proteinene er dynamisk kontrollert. Her vil vi bruke en antistofffôringstilnærming for å kvantifisere nivået av overflate uttryktreseptorer i cellekulturer, så lenge internalisering og resirkulering gjenopptas.Dette er en svært allsidig protokoll, som gir mekanistisk informasjon om regulering av overflate uttryktproteiner. I vårt eksempel vil vi studere glutaminreseptorer i primære hippocampale nevroner. Denne protokollen kan tilpasses ethvert protein som har en anagen ekstracellulær epitop, hvis antistoffer ikke er tilgjengelige, kan transveksjon av merkede konstruksjoner være nyttig for både merking og studier av spesifikke mutasjoner.I våre eksempler bruker vi antistoffer mot endogene GluA1, og tagget Glu12 B.To begynne denne prosedyren, overføre dekselet slips celle side opp til en parafin film dekket brett, for å lagre reagenser, og lette manipulasjon. Lagre og vedlikehold behold beholdte medier ved 37 grader Celsius for inkubasjon og vasketrinn. Inkuber cellene med primære antistoffer fortynnet i betinget media, ved romtemperatur, i 15 minutter.Etter dette, bruk en vakuumpipette til å forsiktig aspirere av antistoffet som inneholder medier, og vask cellene tre ganger med betinget medium. Hvis du studerer overflate versus intracellulær reseptoruttrykk, fikser cellene med paraformaldehyd etter dette trinnet, som beskrevet i tekstprotokollen. Opprettholde cellene i betinget media uten antistoffer, og returnere dem til inkubatoren ved 37 grader Celsius for å tillate internalisering.Hvis du studerer internaliseringsprosessen, må du fikse cellene med paraformaldehyd etter dette trinnet, som beskrevet i tekstprotokollen. For å blokkere epitopene på det primære antistoffet festet til overflaten uttryktreseptorer som ikke har blitt internalisert, inkubere celler med ukonjugert Fab anti-IgG antistofffragmenter fortynnet i betinget media, i 20 minutter ved romtemperatur. Etter dette vasker du cellene tre ganger med betinget medium.Inkuber de vasket brønnene med besamte medier som inneholder 80 mikromolar Dynasore, ved 37 grader Celsius, for å tillate resirkulering av internaliserte reseptorer. Etter å ha fullført endringene på levende celler, vask cellene en gang med PBS pluss. Legg til en løsning på 4% paraformaldehyd og 4% sukrose i PBS til cellene, og inkuber i en røykhette ved romtemperatur i syv til åtte minutter, for å fikse cellene.Vask deretter cellene tre ganger med vanlig PBS. Legg til en løsning på 10% Normal Goat Serum i PBS til cellene, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter, for å blokkere ikke-spesifikke bindingssteder. Deretter inkubere cellene med fluorescerende merket sekundært antistoff fortynnet i 3% NGS i PBS ved romtemperatur i en time, for å merke primære antistoffetikettreseptorer.Etter dette vasker du cellene tre ganger med PBS. For å begynne å merke de intracellulære reseptorene, legg til en løsning på 0,25% TritonX i PBS, og inkuber ved romtemperatur i fem til 10 minutter, for å gjennomsyre cellene. Deretter blokkeres med 10% NGS ved romtemperatur i 30 minutter.Hvis du studerer overflate versus total, inkuber cellene med samme primære antistoff som brukes tidligere, fortynnet med 3% NGS i PBS, ved romtemperatur i en time, for å merke intracellulære reseptorer. Deretter vasker du cellene tre ganger med PBS. Etikett med andre fluorescerende merket sekundært antistoff, fortynnet i 3% NGS i PBS, ved romtemperatur i en time.Etter dette vask cellene tre ganger med PBS. Plasser først dekselslippene, cellesiden ned, på 12 til 15 mikroliter av riktig monteringsmedie for å montere cellene. Deretter bilde cellene på riktig confocal mikroskop, og analysere cellene som beskrevet i tekstprotokollen.Denne protokollen for å studere glutamat reseptorhandel er basert på differensialmerking av reseptorer, uttrykt på celleoverflaten, og de som uttrykkes i interne membraner. Etter å ha fått konfokale bilder, kan det fluorescerende signalet enkelt kvantifiseres for å vise en økning i overflateuttrykk, i forhold til intracellulær populasjon, etter kjemisk LTP. Ingen signal for PSD-95 kan oppnås i ikke-permeabiliserte celler, noe som viser integriteten til plasmamembranen.Dette indikerer at signalet oppnådd for overflaten GluA1 faktisk tilsvarer overflaten uttryktreseptorer. Viktigere, et minimalt signal for internalisert GluA1 kan observeres under ikke-permeabiliseringsforhold, noe som viser at alle overflateepiltoper er okkupert av den første runden med antistoffmerking. Reseptorer som er internalisert, identifiseres deretter.Dette eksemplet fremhever at GluN2B fosforylering ved S1480 fremmer reseptor internalisering. Som fosfomimetisk mutant S1480E viste en mye høyere internalisering forholdet sammenlignet med vill-type reseptorer. Som forventet oppnås det ikke noe signal for internaliserte reseptorer i kontrollen.Deretter identifiseres resirkulerte reseptorer og internaliserte reseptorer. Det genererte resirkuleringsforholdet viser at GluN2B S1480E ikke har noen effekt på NMDAR-resirkulering. I kontrollen kan et sterkt signal observeres for overflate uttrykt GluN2B i fravær av Fab blokkering.Dette signalet forsvinner i Fab-behandlede kulturer, noe som viser at blokkeringsprotokollen er tilstrekkelig til å blokkere overflaten som uttrykkes fullstendig, og at overflatesignalene observert etter resirkulering faktisk tilsvarer reseptorer som er smuglet tilbake til plasmamembranen. Den nåværende protokollen er bare en av metodene som er tilgjengelige for å studere regulering av overflate uttryktproteiner. Andre tilnærminger kan tas for å utvide eller verifisere dataene som er innhentet her.Disse inkluderer biokjemiske metoder, som biotinylering, livsavbildningsteknikker eller funksjonelle tilnærminger, som elektrofysiologi eller kalsiumavbildning. Vi bruker PFA til å fryse lokaliseringen av reseptorer, men PFA er et kjent kreftfremkallende stoff, så det er viktig å utføre trinn ved hjelp av PFA under en røykhette, mens du bruker passende PPE.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalsium Fosfat Transfection of Primary hippocampus nevroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Membranpotensialet Dye Imaging av ventromedial Hypothalamus nerveceller fra voksne mus for å studere Glukose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinvlerina: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approach to Measure Region spesifikke Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Ved hjelp av en α-bungarotoxin Binding Side Tag til Study GABA A-reseptoren Membran Lokalisering og menneskehandel

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen av Neurokar ombygging i Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe-analyse for å studere attraktiv eller frastøtende aktivitet av et protein underlaget med Spaltet hippocampus nevroner

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density Primær Hippocampus Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic hippocampus skive kulturer som en modell å studere Neuroprotection og Invasiveness av kreftceller

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...