Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
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Agradecemos ao centro noroeste de microscopia avançada para o uso do microscópio Nikon a1 confocal e sua assistência no planejamento e análise dos experimentos. Esta pesquisa foi apoiada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e um jovem investigador NARSAD Grant do cérebro & Fundação de pesquisa do comportamento (#24133) (A. S.-C.).

O trabalho relativo à preparação da cultura preliminar hippocampal foi revisto e aprovado pelo Comitê do cuidado animal e do uso da Universidade de Northwestern (protocolo #IS00001151).
1. preparação antes da rotulagem
<ol><li>
Preparação e manutenção de culturas hipocampais primárias
	<ol>
<li>Prepare culturas hippocampal preliminares em uma densidade de 150.000 pilhas chapeadas em poli-D-lysine-revestido (0,1 mg/mL) 18 milímetros cobrem vidros. Excelentes guias...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. 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A interação entre uma célula e seu ambiente (por exemplo, comunicação com outras células, resposta a diferentes estímulos, etc.), depende fortemente da expressão correta dos receptores na superfície celular. O Regulamento rápido e fino-ajustado no conteúdo superfície-expressado do receptor permite a resposta celular apropriada a um ambiente constantemente em mudança. No caso particular dos neurônios, alterações no número, localização, e composição subunidade de receptores sináticamente expressos inf...

As células utilizam o processo ativo de tráfico para mobilizar proteínas para localizações subcelulares específicas e exercer rigorosa regulação espaciotemporal sobre sua função1. Esse processo é especialmente importante para os receptores transmembranares, pois as respostas celulares a diferentes estímulos ambientais dependem de cascatas intracelulares desencadeadas pela ativação do receptor. As células são capazes de modificar essas respostas alterando a densidade, localização e composição da subunidade de receptores expressos na superfície celular através da regulação do tráfico subcelular receptor2. A inserção de receptores recém-sintetizados na membrana plasmática, juntamente com a endocitose e a reciclagem de receptores existentes são exemplos de processos de tráfico que determinam o pool líquido de receptores expressos na superfície2. Muitos mecanismos moleculares cooperam para regular o tráfico de proteínas, incluindo interações proteína-proteína e modificações pós-translacionais, como fosforilação, ubiquitinação ou palmitilação2.
A regulação do tráfico de receptores é particularmente necessária em células fortemente polarizadas com estruturas altamente especializadas. O exemplo paradigmático é o controle da função neuronal pelo tráfico regulamentado de receptores de glutamato (glurs)3,4. O glutamato, o principal neurotransmissor excitatória, liga e ativa os GluRs expressos em superfície para controlar funções neuronais fisiológicas fundamentais, como neurotransmissão sináptica e plasticidade sináptica. O fato de que o tráfico de GluR alterado tem sido observado em um amplo espectro de neuropatias, variando de distúrbios do neurodesenvolvimento a doenças neurodegenerativas, destaca a importância desse processo5. Assim, compreender os acontecimentos moleculares que controlam o tráfico de GluR é de interesse em muitas áreas de pesquisa.
Neste protocolo, um método baseado anticorpo-alimentando é usado para quantificar o nível de GluRs superfície-expressados em neurônios hippocampal preliminares assim como para avaliar como as mudanças na internalização e na reciclagem resultam na expressão líquida observada da superfície. O uso de farmacologia e/ou superexpressão de receptores exógenos que abrigando mutações específicas torna este protocolo uma abordagem particularmente poderosa para o estudo de mecanismos moleculares subjacentes à adaptação neuronal a diferentes estímulos ambientais. Um exemplo final da utilidade deste protocolo é estudar como as mudanças multifatoriais no ambiente (como em modelos de uma doença) afetam o tráfico de GluR através do exame da expressão de superfície em tais modelos.
Usando exemplos específicos, é demonstrado inicialmente como uma manipulação farmacológica que imita a estimulação sináptica physiological [LTP químico (CLTP)] aumenta a expressão de superfície da subunidade endógena do GluA1 do AMPA-tipo de glurs (ampars) 6. o tráfico de uma forma fosfomimética superexpressa da subunidade GluN2B do NMDA-tipo de GluRs (NMDARs) também é analisado para exemplificar como esse protocolo pode ser usado para estudar a regulação do tráfico de GluR por Modificações. Embora estes exemplos específicos sejam usados, este protocolo pode facilmente ser aplicado a outros glurs e outros receptores e proteínas que possuem domínios extracelular antigénicos. No caso de não existirem anticorpos disponíveis para os domínios extracelulares, a superexpressão do epitope-etiquetado extracelular (por exemplo, as proteínas Flag-, Myc-, GFP-Tagged, etc.) podem auxiliar na rotulagem de proteínas.
O protocolo atual fornece instruções para quantificar a densidade específica do subtipo GluR e o tráfico usando anticorpos específicos. Este protocolo pode ser utilizado para estudar 1) expressão de superfície GluR total, 2) internalização GluR e 3) reciclagem de GluR. Para estudar cada processo individualmente, é aconselhável começar com as secções 1 e 2 e continuar com a secção 3, 4 ou 5. Em todos os casos, termine com as secções 6 e 8 (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Respostas celulares a estímulos externos dependem fortemente do conjunto de receptores expressos na superfície celular em um determinado momento. Assim, a população de receptores de superfície expressa está constantemente se adaptando e sujeita a rigorosos mecanismos de regulação. O exemplo paradigmático e um dos eventos de tráfico mais estudados em biologia é o controle regulado da expressão sináptica de receptores de glutamato (GluRs). Os GluRs mediam a grande maioria da neurotransmissão excitatória no sistema nervoso central e controlam mudanças funcionais e estruturais dependentes da atividade fisiológica nos níveis sinápticos e neuronais (por exemplo, plasticidade sináptica). As modificações no número, na posição, e na composição do subunidade de glurs expressados superfície afetam profundamente a função neuronal e, de facto, as alterações nestes fatores são associadas com os neuropathies diferentes. Aqui apresentamos um método para estudar o tráfico de GluR em neurônios primários hipocampais dissociados. Uma abordagem de "alimentação de anticorpos" é usada para visualizar diferencialmente as populações de GluR expressas na superfície e nas membranas internas. Ao rotular receptores de superfície em células ao vivo e fixá-los em momentos diferentes para permitir a endocitose e/ou reciclagem de receptores, esses processos de tráfico podem ser avaliados e seletivamente estudados. Este é um protocolo versátil que pode ser usado em combinação com abordagens farmacológicas ou superexpressão de receptores alterados para obter informações valiosas sobre estímulos e mecanismos moleculares que afetam o tráfico de GluR. Similarmente, pode facilmente ser adaptado para estudar outros receptores ou proteínas expressadas superfície.

Este protocolo para estudar o tráfico de receptores de glutamato é baseado na rotulagem diferencial dos receptores expressos na superfície celular e naqueles expressos em membranas internas. A segregação é conseguida pela rotulagem dos receptores antes e após a permeabilização da membrana, utilizando o mesmo anticorpo primário, mas um anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo diferente. Como descrito pelas etapas opcionais incluíram o protocolo, trata-se de um método ...

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An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Este artigo apresenta um método para estudar o tráfico de receptores de glutamato (GluR) em culturas hipocampais primárias dissociadas. Usando uma abordagem de alimentação de anticorpos para rotular receptores endógenos ou superexpressos em combinação com abordagens farmacológicas, este método permite a identificação de mecanismos moleculares que regulam a expressão da superfície GluR modulando processos de internalização ou reciclagem.

Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

As respostas celulares aos estímulos externos dependem fortemente do conjunto de proteínas que são expressas na superfície celular em um dado momento. Assim, o número, a localização subcelular e a composição subunidade dessas proteínas são controlados dinamicamente. Aqui, usaremos uma abordagem de alimentação de anticorpos para quantificar o nível de receptores expressos na superfície nas culturas celulares, desde que a internalização e a reciclagem retomem.Trata-se de um protocolo muito versátil, que fornece informações mecanicistas da regulação das proteínas expressas em superfície. Em nosso exemplo, estudaremos receptores de glutamina em neurônios hipocampais primários. Este protocolo pode ser adaptado a qualquer proteína que possua um epítope extracelular anagênico, se os anticorpos não estão disponíveis, a transvecção de construções marcadas pode ser útil tanto para rotular quanto para estudar mutações específicas.Em nossos exemplos, usamos anticorpos contra glua1 endógeno, e marcamos Glu12 B.To iniciar este procedimento, transferir a capa desliza lado da célula até uma bandeja coberta de filme de parafina, para salvar reagentes e facilitar a manipulação. Salve e mantenha a mídia condicionada a 37 graus Celsius para incubação e lavagem de passos. Incubar as células com anticorpos primários diluídos em mídia condicionada, em temperatura ambiente, por 15 minutos.Depois disso, use uma pipeta de vácuo para aspirar cuidadosamente o anticorpo que contém mídia, e lave as células três vezes com mídia condicionada. Se estudar a expressão superficial versus receptor intracelular fixe as células com paraformaldeído após esta etapa, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha as células em mídia condicionada sem anticorpos, e devolva-as à incubadora a 37 graus Celsius para permitir a internalização.Se estudar o processo de internalização, fixar as células com paraformaldeído após esta etapa, conforme descrito no protocolo de texto. Para bloquear os epítopos do anticorpo primário ligado à superfície, os receptores expressos que não foram internalizados, incubam células com fragmentos de anticorpos anti-IgG fab não julgados diluídos em mídia condicionada, por 20 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, lave as células três vezes com mídia condicionada.Incubar os poços lavados com mídia condicionada contendo 80 dynasores micromolar, a 37 graus Celsius, para permitir a reciclagem de receptores internalizados. Depois de terminar as modificações em células vivas, lave as células uma vez com PBS plus. Adicione uma solução de 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em PBS às células, e incubar em um capô de fumaça à temperatura ambiente por sete a oito minutos, para consertar as células.Em seguida, lave as células três vezes com PBS regular. Adicione uma solução de soro de cabra 10% normal em PBS às células e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos, para bloquear locais de ligação não específicos. Em seguida, incubar as células com anticorpo secundário fluorescente com marcação fluorescente diluída em 3%NGS em PBS em temperatura ambiente por uma hora, para rotular receptores de rótulos de anticorpos primários.Depois disso, lave as células três vezes com PBS. Para começar a rotular os receptores intracelulares, adicione uma solução de 0,25% TritonX em PBS e incubar à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos, para permeabiliizar as células. Em seguida, bloqueie com 10% de NGS em temperatura ambiente por 30 minutos.Se estudar superfície versus total, incubar as células com o mesmo anticorpo primário usado anteriormente, diluído com 3%NGS em PBS, em temperatura ambiente por uma hora, para rotular os receptores intracelulares. Em seguida, lave as células três vezes com PBS. Etiqueta com segundo anticorpo secundário marcado fluorescentemente, diluído em 3% NGS em PBS, em temperatura ambiente por uma hora.Depois desta lavagem as células três vezes com PBS. Primeiro coloque suavemente os deslizamentos de cobertura, lado da célula para baixo, em 12 a 15 microliters da mídia de montagem apropriada para montar as células. Em seguida, imagem as células no microscópio confocal apropriado, e analisar as células como descrito no protocolo de texto.Este protocolo para estudar o tráfico de receptores de glutamato baseia-se na rotulagem diferencial dos receptores, expressos na superfície celular, e aqueles expressos em membranas internas. Após a aquisição de imagens confocal, o sinal fluorescente pode ser facilmente quantificado para mostrar um aumento na expressão da superfície, em relação à população intracelular, seguindo a LTP química. Nenhum sinal para PSD-95 pode ser obtido em células não permeabilizadas, demonstrando a integridade da membrana plasmática.Isso indica que o sinal obtido para a superfície GluA1 corresponde de fato aos receptores expressos na superfície. É importante ressaltar que um sinal mínimo para GluA1 internalizado pode ser observado em condições de não permeabilização, mostrando que todos os epítopos de superfície são ocupados pela rodada inicial de rotulagem de anticorpos. Os receptores que foram internalizados são então identificados.Este exemplo destaca que a fosforilação GluN2B em S1480 promove a internalização do receptor. Como o mutante fosfomimetic S1480E apresentou uma taxa de internalização muito maior em comparação com receptores do tipo selvagem. Como esperado, nenhum sinal é obtido para receptores internalizados no controle.Em seguida, são identificados receptores reciclados e receptores internalizados. A razão de reciclagem gerada mostra que o GluN2B S1480E não tem efeito na reciclagem do NMDAR. No controle, pode-se observar um sinal forte para o GluN2B expresso na superfície expressa na ausência de bloqueio fab.Este sinal desaparece nas culturas tratadas pela Fab, demonstrando que o protocolo de bloqueio é suficiente para bloquear completamente os epítopos expressos da superfície, e que os sinais de superfície observados após a reciclagem correspondem de fato aos receptores traficados de volta para a membrana plasmática. O protocolo atual é apenas um dos métodos disponíveis para estudar a regulação de proteínas expressas em superfície. Outras abordagens podem ser tomadas para expandir ou verificar os dados obtidos aqui.Estes incluem métodos bioquímicos, como biotinilação, técnicas de imagem de vida ou abordagens funcionais, como eletrofisiologia ou imagem de cálcio. Usamos PFA para congelar a localização de receptores, porém o PFA é um cancerígeno conhecido, por isso é crucial executar etapas usando PFA sob um capô de fumaça, enquanto usa EPI apropriado.

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