Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

Мы благодарим Северо-Западный центр расширенной микроскопии за использование микроскопа Nikon A1 Confocal и их помощь в планировании и анализе экспериментов. Это исследование было поддержано NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), и NIA (R00AG041225) и ГРАНТом для молодых исследователей NARSAD от Фонда исследований мозга и поведения (#24133) (A. S. -C.).

Работа, связанная с подготовкой гиппокампа первичной культуры была рассмотрена и одобрена Северо-Западным университетом по уходу за животными и использованием комитета (протокол #IS00001151).
1. Подготовка перед маркировкой
<ol><li>
Подготовка и поддержание первичных гипп?...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+(NMDA)+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+(AMPA)+Receptors+by+Posttranslational+Modifications.">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons.">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition:+Many+Regulators,+Many+Consequences.">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation.">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient.">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li><li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).</li></ol>

Взаимодействие между клеткой и ее окружающей средой (например, общение с другими клетками, реакция на различные раздражители и т.д.), в значительной степени зависит от правильного выражения рецепторов на поверхности клетки. Быстрая и отлаженная регуляция содержания поверхностных реце?...

Клетки используют активный процесс торговли, чтобы мобилизовать белки к конкретным субклеточным локализациям и осуществлять строгую пространственно-временное регулирование над их функцией1. Этот процесс особенно важен для трансмембранных рецепторов, так как клеточные реакции на различные экологические стимулы опираются на внутриклеточные каскады, вызванные активацией рецепторов. Клетки способны изменять эти реакции, изменяя плотность, локализацию и состав субъединиц рецепторов, выраженных на поверхности клетки через регулирование субклеточного оборота рецепторов2. Вставка вновь синтезированных рецепторов в плазменную мембрану, наряду с эндоцитозом и рециркуляцией существующих рецепторов являются примерами процессов торговли людьми, которые определяют чистый пул поверхностно выраженных рецепторов2. Многие молекулярные механизмы сотрудничают для регулирования торговли белками, включая белково-белковые взаимодействия и постпереводные модификации, такие как фосфорилирование, убиквитинация или пальмитоилация2.
Регулирование оборота рецепторов особенно необходимо в сильно поляризованных клетках с узкоспециализированными структурами. Парадигматический пример является контроль нейронной функции регулируемой торговли рецепторами глутамата (GluRs)3,4. Глутамат, основной возбуждательный нейромедиатор, связывает и активирует поверхностно-выраженные GluRs для управления фундаментальными физиологическими нейрональными функциями, такими как синаптической нейротрансмиссии и синаптической пластичности. Тот факт, что измененный клей торговли наблюдается в широком спектре невропатий, начиная от нейроразвития расстройств нейродегенеративных заболеваний, подчеркивает важность этого процесса5. Таким образом, понимание молекулярных событий, контролирующих торговлю GluR, представляет интерес во многих областях исследований.
В этом протоколе метод кормления антител используется для количественной оценки уровня поверхностных глюров в первичных гиппокампальных нейронах, а также для оценки того, как изменения в интернализации и рециркуляции приводят к наблюдаемому чистому экспрессии поверхности. Использование фармакологии и/или переэкспрессии экзогенных рецепторов, укрывающих специфические мутации, делает этот протокол особенно мощным подходом к изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе нейронной адаптации к различным экологическим стимулам. Последним примером полезности этого протокола является изучение того, как многофакторные изменения в окружающей среде (например, в моделях заболеваний) влияют на торговлю GluR путем изучения поверхностного выражения в таких моделях.
Используя конкретные примеры, первоначально показано, как фармакологические манипуляции, имитирующие физиологическую синаптической стимуляции (cLTP) увеличивает поверхностное выражение эндогенного подразделения GluA1 амрац-типа GluRs (AMPARs) 6.Торговля чрезмерно выраженной фосфо-миметической формой подразделения GluN2B NMDA-типа GluRs (NMDARs) также анализируется для примера того, как этот протокол может быть использован для изучения регулирования оборота ГлюР конкретными постпереводами Изменения. Хотя эти конкретные примеры используются, этот протокол может быть легко применен к другим GluRs и других рецепторов и белков, которые обладают антигенными внеклеточными доменами. В случае, если нет антител, доступных для внеклеточных доменов, переэкспрессия внеклеточных эпитопных меток (например, флаг-, Myc-, GFP-тегами и т.д.) белки могут помочь в маркировке белка.
В настоящем протоколе содержатся инструкции по количественной оценке конкретной плотности подтипов GluR и оборота с использованием конкретных антител. Этот протокол может быть использован для изучения 1) общего выражения поверхности GluR, 2) интернализации GluR и 3) переработки GluR. Для изучения каждого процесса индивидуально рекомендуется начинать с разделов 1 и 2 и продолжать либо раздел 3, 4, или 5. Во всех случаях, закончить с разделами 6 и 8(Рисунок 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Клеточные реакции на внешние раздражители в значительной степени полагаются на набор рецепторов, выраженных на поверхности клетки в данный момент. Соответственно, популяция поверхностно выраженных рецепторов постоянно адаптируется и подчиняется строгим механизмам регулирования. Парадигматический пример и один из наиболее изученных событий торговли людьми в биологии является регулируемый контроль синаптической экспрессии рецепторов глутамата (GluRs). GluRs посредничают в подавляющем большинстве возбуждающих нейротрансмиссии в центральной нервной системе и контролируют физиологическую активность-зависимые функциональные и структурные изменения на синаптических и нейрональных уровнях (например, синаптической пластичности). Изменения в количестве, местоположении и составе субъединиц поверхности, выраженные Глюры, глубоко влияют на функцию нейронов и, по сути, изменения в этих факторах связаны с различными невропатиями. Представлено здесь метод для изучения GluR торговли в диссоциированных гиппокампа первичных нейронов. Подход «кормления антител» используется для дифференциализации популяций ГлюР, выраженных на поверхности и внутренних мембранах. Путем маркировки поверхностных рецепторов на живых клетках и фиксируя их на разное время для того чтобы позволить для приемных устройств endocytosis and/or рециркулировать, эти процессы торговли можно оценить и селективно изучить. Это универсальный протокол, который может быть использован в сочетании с фармакологическими подходами или переэкспрессией измененных рецепторов, чтобы получить ценную информацию о стимулах и молекулярных механизмах, влияющих на торговлю GluR. Аналогичным образом, он может быть легко адаптирован для изучения других рецепторов или поверхностных протеинов.

Этот протокол для изучения торговли рецепторами глутамата основан на дифференциальной маркировке рецепторов, выраженных на поверхности клетки, и тех, которые выражены во внутренних мембранах. Сегрегация достигается путем маркировки рецепторов до и после мембраны per...

Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

В этой статье представлен метод изучения глутаматных рецепторов (GluR) в разъединенных первичных гиппокампальных культурах. Используя подход к кормлению антител для маркировки эндогенных или переэкспрессированных рецепторов в сочетании с фармакологическими подходами, этот метод позволяет выявлять молекулярные механизмы, регулирующие экспрессию поверхности ГлюР путем модулирования процессов интернализации или рециркуляции.

Подход к кормлению антител для изучения торговли рецепторами глутамата в диссоциированных первичных гиппокампальных культурах

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Клеточные реакции на внешние раздражители в значительной степени зависят от набора белков, которые выражаются на поверхности клетки в данный момент. Соответственно, количество, субклеточная локализация и подраздимовый состав этих белков динамически контролируются. Здесь мы будем использовать подход к кормлению антителами для количественной оценки уровня поверхностных выраженных рецепторов в клеточных культурах, до тех пор, пока интернализация и рециркуляция возобновляются.Это очень универсальный протокол, который предоставляет механистическую информацию о регуляции поверхностных выраженных белков. В нашем примере мы будем изучать рецепторы глутамина в первичных нейронах гиппокампа. Этот протокол может быть адаптирован к любому белку, обладая анагенным внеклеточным эпитопом, если антител нет, трансвекция помеченных конструкций может быть полезна как для маркировки, так и для изучения конкретных мутаций.В наших примерах, мы используем антитела против эндогенных GluA1, и помечены Glu12 B.To начать эту процедуру, передача крышки скользит клеточной стороне до парафиновой пленки покрыты лоток, чтобы сохранить реагенты, и облегчить манипуляции. Сохранить и поддерживать кондиционированные средства массовой информации на 37 градусов по Цельсию для инкубации и мытья шагов. Инкубировать клетки с первичными антителами, разбавленных в условных средств массовой информации, при комнатной температуре, в течение 15 минут.После этого используйте вакуумную пипетку, чтобы тщательно аспирировать антитела, содержащие средства массовой информации, и мыть клетки три раза с условным средством массовой информации. При изучении поверхности по сравнению с внутриклеточным рецептором выражение исправить клетки с параформальдегидом после этого шага, как указано в текстовом протоколе. Поддерживайте клетки в кондиционированных средствах массовой информации без антител, и вернуть их в инкубатор при 37 градусах по Цельсию, чтобы обеспечить интернализацию.При изучении процесса интернизации, исправить клетки с параформальдегидом после этого шага, как указано в текстовом протоколе. Чтобы блокировать эпитопы на первичных антителах, прикрепленных к поверхности выраженных рецепторов, которые не были интернализированы, инкубировать клетки с неконъюгированных Fab анти-IgG фрагменты антител, разбавленных в условных средств массовой информации, в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого, мыть клетки три раза с условными средствами массовой информации.Инкубировать промытые колодцы с условным средством, содержащим 80 микромолейных династий, при 37 градусах по Цельсию, чтобы обеспечить рециркуляцию интернализированных рецепторов. После окончания модификации на живых клетках, мыть клетки один раз с PBS плюс. Добавить раствор 4%paraformaldehyde и 4% сахарозы в PBS в клетки, и инкубировать в капоте дыма при комнатной температуре в течение семи-восьми минут, чтобы исправить клетки.Затем мыть клетки три раза с регулярными PBS. Добавить раствор 10%Нормальная сыворотка козы в PBS к клеткам, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы блокировать неспецифические сайты связывания. Далее, инкубировать клетки с флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленных в 3%NGS в PBS при комнатной температуре в течение одного часа, для обозначения первичных рецепторов этикетки антитела.После этого, мыть клетки три раза с PBS. Чтобы начать маркировку внутриклеточных рецепторов, добавьте раствор 0,25%TritonX в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти-десяти минут, чтобы пронизать клетки. Затем блок с 10%NGS при комнатной температуре в течение 30 минут.При изучении поверхности по сравнению с общей, инкубировать клетки с тем же первичным антителом, используемым ранее, разбавленный 3%NGS в PBS, при комнатной температуре в течение одного часа, для обозначения внутриклеточных рецепторов. Затем, мыть клетки три раза с PBS. Этикетка со вторым флуоресцентно помеченным вторичным антителом, разбавленным в 3%NGS в PBS, при комнатной температуре в течение одного часа.После этого мыть клетки три раза с PBS. Сначала аккуратно поместите крышку скользит, ячейка стороной вниз, на 12 до 15 микролитров соответствующих монтажных средств для установки клеток. Затем изувечение клеток на соответствующем конфокальцаторе и анализируйте клетки, изложенные в текстовом протоколе.Этот протокол для изучения торговли рецепторами глутамата основан на дифференциальной маркировке рецепторов, выраженных на поверхности клетки, и тех, которые выражаются во внутренних мембранах. После получения конфокальных изображений, флуоресцентный сигнал может быть легко количественно, чтобы показать увеличение выражения поверхности, по отношению к внутриклеточной популяции, после химического LTP. Ни один сигнал для PSD-95 не может быть получен в не-проницаемых клетках, демонстрируя целостность плазменной мембраны.Это указывает на то, что сигнал, полученный для поверхности GluA1 действительно соответствует поверхностным выраженным рецепторам. Важно отметить, что минимальный сигнал для интернализированного GluA1 можно наблюдать в условиях непроницаемой, показывая, что все поверхностные эпитопы заняты первоначальным раундом маркировки антител. Рецепторы, которые были интернализированы затем определены.Это пример подчеркивает, что фосфорилирование GluN2B на S1480 способствует интернализации рецепторов. Как фосфомиметический мутант S1480E отображается гораздо более высокий коэффициент интернализации по сравнению с рецепторами дикого типа. Как и ожидалось, сигнал для интернализированных рецепторов в элементе управления не получен.Далее идентифицируются переработанные рецепторы и интернализированные рецепторы. Коэффициент переработки показывает, что GluN2B S1480E не влияет на переработку NMDAR. В управлении, сильный сигнал можно наблюдать для поверхности выраженной GluN2B в отсутствии блокирования Fab.Этот сигнал исчезает в культурах, обработанных Fab, демонстрируя, что протокол блокировки достаточен, чтобы полностью блокировать выраженные эпитопы поверхности, и что поверхностные сигналы, наблюдаемые после переработки, действительно соответствуют рецепторам, проданным обратно в плазменную мембрану. Текущий протокол является лишь одним из методов, доступных для изучения регулирования поверхностных выраженных белков. Другие подходы могут быть приняты для расширения или проверки данных, полученных здесь.К ним относятся биохимические методы, как биотинилирование, методы визуализации жизни, или функциональные подходы, такие как электрофизиология или кальциевая визуализация. Мы используем PFA, чтобы заморозить локализацию рецепторов, однако PFA является известным канцерогеном, поэтому очень важно выполнить шаги с использованием PFA под капотом дыма, при ношении соответствующих СИЗ.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Органотипической гиппокампа культур фрагмент

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Мембранный потенциал Краска Визуализация вентромедиального Hypothalamus нейроны от взрослых мышей по изучению глюкозы Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Анализ нейрососудистой ремоделирования в Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay по изучению притягательные или отталкивающие активность белка подложки с использованием диссоциированных нейронах гиппокампа

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Низкая плотность первичного гиппокамп Нейрон культура

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic гиппокампа ломтик культур как модель для изучения нейропротекции и инвазии опухолевых клеток

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...