Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
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Agradecemos al Northwestern Center for Advanced Microscopy por el uso del microscopio Nikon A1 Confocal y su asistencia en la planificación y análisis de los experimentos. Esta investigación fue apoyada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), y NIA (R00AG041225) y una Beca de Investigador Joven NARSAD de la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento (#24133) (A. S. -C.).

El Trabajo relacionado con la preparación del cultivo primario hipocampal fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern (protocolo #IS00001151).
1. Preparación antes del etiquetado
<ol><li>
Preparación y mantenimiento de las culturas primarias del hipocampo
	<ol>
<li>Preparar cultivos primarios de hipocampo a una densidad de 150.000 células chapadas en gafas de cubierta recubiertas de poli-D-lisina (0,1 mg/ml) de 18 mm...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. 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La interacción entre una célula y su entorno (por ejemplo, la comunicación con otras células, la respuesta a diferentes estímulos, etc.), depende en gran medida de la expresión correcta de los receptores en la superficie celular. La regulación rápida y ajustada en el contenido del receptor expresado en la superficie permite una respuesta celular adecuada a un entorno en constante cambio. En el caso particular de las neuronas, las alteraciones en el número, la localización y la composición de subunidades de los...

Las células utilizan el proceso activo de tráfico para movilizar proteínas a localizaciones subcelulares específicas y ejercer una estricta regulación espaciotemporal sobre su función1. Este proceso es especialmente importante para los receptores transmembrana, ya que las respuestas celulares a diferentes estímulos ambientales dependen de cascadas intracelulares desencadenadas por la activación del receptor. Las células son capaces de modificar estas respuestas alterando la densidad, localización y composición de subunidades de los receptores expresada en la superficie celular a través de la regulación del tráfico subcelular de receptores2. La inserción de receptores recién sintetizados en la membrana plasmática, junto con la endocitosis y el reciclaje delos receptores existentes son ejemplos de procesos de tráfico que determinan el conjunto neto de receptores expresados en superficie 2. Muchos mecanismos moleculares cooperan para regular el tráfico de proteínas, incluidas las interacciones proteína-proteína y las modificaciones posttranslacionales, como la fosforilación, la ubiquitinación o la palmitoylación2.
La regulación del tráfico de receptores es particularmente necesaria en células fuertemente polarizadas con estructuras altamente especializadas. El ejemplo paradigmático es el control de la función neuronal mediante el tráfico regulado de receptores de glutamato (GluRs)3,4. El glutamato, el principal neurotransmisor excitatorio, se une y activa los GluRs expresados por la superficie para controlar las funciones neuronales fisiológicas fundamentales como la neurotransmisión sináptica y la plasticidad sináptica. El hecho de que se haya observado el tráfico de GluR alterado en un amplio espectro de neuropatías, que van desde trastornos del neurodesarrollo hasta enfermedades neurodegenerativas, pone de relieve la importancia de este proceso5. Por lo tanto, entender los eventos moleculares que controlan el tráfico de GluR es de interés en muchas áreas de investigación.
En este protocolo, se utiliza un método basado en la alimentación de anticuerpos para cuantificar el nivel de GluRs expresados por la superficie en las neuronas primarias del hipocampo, así como evaluar cómo los cambios en la internalización y el reciclaje dan lugar a la expresión de superficie neta observada. El uso de farmacología y/o sobreexpresión de receptores exógenos que albergan mutaciones específicas hace de este protocolo un enfoque particularmente poderoso para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la adaptación neuronal a diferentes estímulos ambientales. Un ejemplo final de la utilidad de este protocolo es estudiar cómo los cambios multifactoriales en el medio ambiente (como en los modelos de una enfermedad) afectan el tráfico de GluR a través del examen de la expresión superficial en estos modelos.
Utilizando ejemplos específicos, inicialmente se demuestra cómo una manipulación farmacológica imitando la estimulación sináptica fisiológica [LTP químico (cLTP)] aumenta la expresión superficial de la subunidad Endógena GluA1 del tipo AMPA de GluRs (AMPARs) 6. El tráfico de una forma fosfomimética sobreexpresada de la subunidad GluN2B de GluRs de tipo NMDA (NMDAR) también se analiza para ejemplificar cómo este protocolo puede utilizarse para estudiar la regulación del tráfico de GluR por Modificaciones. Aunque se utilizan estos ejemplos específicos, este protocolo se puede aplicar fácilmente a otros GluRs y otros receptores y proteínas que poseen dominios extracelulares antigénicos. En el caso de que no haya anticuerpos disponibles para dominios extracelulares, la sobreexpresión de proteínas extracelulares etiquetadas con epítopos (por ejemplo, Flag-, Myc-, GFP-tagged, etc.) puede ayudar en el etiquetado de proteínas.
El protocolo actual proporciona instrucciones para cuantificar la densidad específica de subtipos GluR y el tráfico utilizando anticuerpos específicos. Este protocolo se puede utilizar para estudiar 1) expresión total de la superficie GluR, 2) internalización de GluR, y 3) reciclaje de GluR. Para estudiar cada proceso individualmente, se aconseja comenzar con las secciones 1 y 2 y continuar con las secciones 3, 4 o 5. En todos los casos, termine con las secciones 6 y 8 (Figura1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Las respuestas celulares a los estímulos externos dependen en gran medida del conjunto de receptores expresados en la superficie celular en un momento dado. En consecuencia, la población de receptores expresados en superficie se está adaptando constantemente y sujeta a estrictos mecanismos de regulación. El ejemplo paradigmático y uno de los eventos de tráfico más estudiados en biología es el control regulado de la expresión sináptica de los receptores de glutamato (GluR). Los GluR median la gran mayoría de la neurotransmisión excitatoria en el sistema nervioso central y controlan los cambios funcionales y estructurales dependientes de la actividad fisiológica a los niveles sináptico y neuronal (por ejemplo, plasticidad sináptica). Las modificaciones en el número, la ubicación y la composición de la subunidad de los GluR expresados en superficie afectan profundamente la función neuronal y, de hecho, las alteraciones en estos factores se asocian con diferentes neuropatías. Presentado aquí es un método para estudiar el tráfico de GluR en las neuronas primarias del hipocampo disociadas. Se utiliza un enfoque de "alimentación de anticuerpos" para visualizar diferencialmente las poblaciones de GluR expresadas en la superficie y las membranas internas. Mediante el etiquetado de receptores de superficie en células vivas y la fijación en diferentes momentos para permitir la endotosis de receptores y / o reciclaje, estos procesos de tráfico pueden ser evaluados y estudiados selectivamente. Este es un protocolo versátil que se puede utilizar en combinación con enfoques farmacológicos o sobreexpresión de receptores alterados para obtener información valiosa sobre los estímulos y mecanismos moleculares que afectan el tráfico de GluR. Del mismo modo, se puede adaptar fácilmente para estudiar otros receptores o proteínas expresadas en la superficie.

Este protocolo para estudiar el tráfico de receptores de glutamato se basa en el etiquetado diferencial de los receptores expresados en la superficie celular y los expresados en membranas internas. La segregación se logra mediante el etiquetado de los receptores antes y después de la permeabilización de la membrana, utilizando el mismo anticuerpo primario pero un anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo diferente. Como se describe en los pasos opcionales incluidos el protocolo...

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An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.

Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Las respuestas celulares a los estímulos externos dependen en gran medida del conjunto de proteínas que se expresan en la superficie celular en un momento dado. En consecuencia, el número, la localización subcelular y la composición de subunidades de estas proteínas se controlan dinámicamente. Aquí, utilizaremos un enfoque de alimentación de anticuerpos para cuantificar el nivel de receptores expresados en superficie en cultivos celulares, siempre y cuando se reanude la internalización y el reciclaje.Este es un protocolo muy versátil, que proporciona información mecanicista de la regulación de las proteínas expresadas en superficie. En nuestro ejemplo, estudiaremos los receptores de glutamina en las neuronas hipocampales primarias. Este protocolo se puede adaptar a cualquier proteína que posea un epilátopo extracelular anagénico, si no hay anticuerpos disponibles, la transvección de construcciones etiquetadas puede ser útil tanto para el etiquetado como para el estudio de mutaciones específicas.En nuestros ejemplos, utilizamos anticuerpos contra GluA1 endógenos, y etiquetado Glu12 B.To comenzar este procedimiento, transferir la cubierta desliza el lado de la célula a una bandeja cubierta de película de parafina, para guardar reactivos y facilitar la manipulación. Guarde y mantenga los medios acondicionados a 37 grados centígrados para la incubación y los pasos de lavado. Incubar las células con anticuerpos primarios diluidos en medios acondicionados, a temperatura ambiente, durante 15 minutos.Después de esto, utilice una pipeta de vacío para aspirar cuidadosamente el anticuerpo que contiene medios, y lave las células tres veces con medios acondicionados. Si estudia la superficie frente a la expresión del receptor intracelular, corrija las células con paraformaldehído después de este paso, como se describe en el protocolo de texto. Mantener las células en medios condicionados sin anticuerpos, y devolverlas a la incubadora a 37 grados Celsius para permitir la internalización.Si estudia el proceso de internalización, corrija las celdas con paraformaldehído después de este paso, como se describe en el protocolo de texto. Para bloquear los epítopos en el anticuerpo primario unido a la superficie expresó receptores que no han sido internalizados, incubar células con fragmentos de anticuerpos Anti-IgG Fab no conjurados diluidos en medios condicionados, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, lave las células tres veces con medios acondicionados.Incubar los pozos lavados con medios acondicionados que contengan 80 micras de 80 micromolares Dynasore, a 37 grados centígrados, para permitir el reciclaje de receptores internalizados. Después de terminar las modificaciones en células vivas, lave las células una vez con PBS plus. Añadir una solución de 4%paraformaldehído y 4%sacarosa en PBS a las células, e incubar en una campana de humo a temperatura ambiente durante siete a ocho minutos, para fijar las células.Luego lave las células tres veces con PBS regular. Añadir una solución de 10%Normal Goat Serum en PBS a las células, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, para bloquear sitios de unión no específicos. A continuación, incubar las células con anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente diluidos en 3%NGS en PBS a temperatura ambiente durante una hora, para etiquetar los receptores primarios de la etiqueta de anticuerpos.Después de esto, lave las células tres veces con PBS. Para comenzar a etiquetar los receptores intracelulares, añadir una solución de 0.25%TritonX en PBS, e incubar a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos, para permeabilizar las células. A continuación, bloquee con 10%NGS a temperatura ambiente durante 30 minutos.Si estudia la superficie frente al total, incubar las células con el mismo anticuerpo primario utilizado anteriormente, diluidas con 3%NGS en PBS, a temperatura ambiente durante una hora, para etiquetar los receptores intracelulares. A continuación, lave las células tres veces con PBS. Etiqueta con segundo anticuerpo secundario con etiqueta fluorescente, diluido en 3%NGS en PBS, a temperatura ambiente durante una hora.Después de esto lavar las células tres veces con PBS. En primer lugar coloque suavemente los resbalones de la cubierta, el lado de la celda hacia abajo, en 12 a 15 microlitros del medio de montaje adecuado para montar las células. A continuación, imagine las celdas en el microscopio confocal adecuado y analice las celdas como se describe en el protocolo de texto.Este protocolo para estudiar el tráfico de receptores de glutamato se basa en el etiquetado diferencial de los receptores, expresado en la superficie celular, y los expresados en las membranas internas. Después de adquirir imágenes confocales, la señal fluorescente se puede cuantificar fácilmente para mostrar un aumento en la expresión superficial, en relación con la población intracelular, después de LTP químico. No se puede obtener ninguna señal para PSD-95 en células no permeabilizadas, lo que demuestra la integridad de la membrana plasmática.Esto indica que la señal obtenida para la superficie GluA1 corresponde efectivamente a los receptores expresados en superficie. Es importante destacar que se puede observar una señal mínima para GluA1 internalizado en condiciones no permeabilización, lo que demuestra que todos los epítopos de la superficie están ocupados por la ronda inicial de etiquetado de anticuerpos. A continuación, se identifican los receptores que se han interiorizado.Este ejemplo destaca que la fosforilación GluN2B en S1480 promueve la internalización del receptor. Como el mutante fosfomimético S1480E mostró una relación de internalización mucho mayor en comparación con los receptores de tipo salvaje. Como era de esperar, no se obtiene ninguna señal para los receptores internalizados en el control.A continuación, se identifican los receptores reciclados y los receptores internalizados. La relación de reciclaje generada muestra que GluN2B S1480E no tiene ningún efecto en el reciclaje NMDAR. En el control, se puede observar una señal fuerte para la superficie expresada GluN2B en ausencia de bloqueo Fab.Esta señal desaparece en los cultivos tratados con Fab, demostrando que el protocolo de bloqueo es suficiente para bloquear completamente la superficie expresada epítopos, y que las señales superficiales observadas después del reciclaje corresponden efectivamente a los receptores traficados de vuelta a la membrana plasmática. El protocolo actual es sólo uno de los métodos disponibles para estudiar la regulación de las proteínas expresadas en superficie. Se pueden tomar otros enfoques para ampliar o verificar los datos obtenidos aquí.Estos incluyen métodos bioquímicos, como biotinilación, técnicas de imagen de vida o enfoques funcionales, como electrofisiología o imágenes de calcio. Utilizamos PFA para congelar la localización de receptores, sin embargo PFA es un carcinógeno conocido, por lo que es crucial realizar pasos usando PFA bajo una campana de humo, mientras usa el EPP adecuado.

Research

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