Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

Vi tackar Northwestern Center för avancerad mikroskopi för användning av Nikon a1 konfokala Mikroskop och deras hjälp med att planera och analysera experimenten. Denna forskning stöddes av NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), och NIA (R00AG041225) och ett NARSAD Young Investigator Grant från hjärnan & beteende Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Arbete som hänför sig till Hippocampus primär kultur beredning granskades och godkändes av Northwestern University djuromsorg och användning kommittén (protokoll #IS00001151).
1. Förberedelser före märkning
<ol><li>
Beredning och underhåll av primära Hippocampus kulturer
	<ol>
<li>Förbered primära Hippocampus kulturer vid en densitet av 150 000 celler pläterade på Poly-D-lysin-belagda (0,1 mg/ml) 18 mm täckglas. Utmärkta guider för dissocierad neuronala kul...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+(NMDA)+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+(AMPA)+Receptors+by+Posttranslational+Modifications.">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons.">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition:+Many+Regulators,+Many+Consequences.">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation.">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient.">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li><li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).</li></ol>

Samspelet mellan en cell och dess omgivning (t. ex. kommunikation med andra celler, respons på olika stimuli, etc.), är starkt beroende av det korrekta uttrycket av receptorer på cellytan. Den snabba och finjusterade regleringen i ytan-uttryckt receptor innehåll möjliggör korrekt cellulära svar på en ständigt föränderlig miljö. I det särskilda fallet av nervceller, förändringar i antalet, lokalisering, och subenhet sammansättning synaptically uttryckt receptorer starkt påverkar synaptisk kommunikation, s...

Celler utnyttjar den aktiva processen för människohandel för att mobilisera proteiner till specifika subcellulära lokaliseringar och utöva strikt spatiotemporal reglering över sin funktion1. Denna process är särskilt viktigt för transmembranreceptorer, som cellulära svar på olika miljömässiga stimuli förlitar sig på intracellulära kaskader utlöses av receptor aktivering. Celler kan ändra dessa svar genom att ändra täthet, lokalisering, och subenhet sammansättning av receptorer uttrycks på cellytan via receptor subcellulära människohandel regulation2. Införandet av nyligen syntetiserade receptorer i plasmamembranet, tillsammans med endocytos och återvinning av befintliga receptorer är exempel på människohandel processer som avgör nätet pool av ytan-uttryckta receptorer2. Många molekylära mekanismer samverkar för att reglera protein handel, inklusive protein-protein interaktioner och posttranslationella modifieringar såsom fosforylering, ubiquitination, eller palmitoylation2.
Regleringen av receptor handel krävs bestämt i starkt polariserade celler med högt specialiserade strukturerar. Det paradigmatiska exemplet är kontrollen av neuronala funktion genom reglerad handel med glutamatreceptorer (glurs)3,4. Glutamat, den huvudsakliga excitatoriska neurotransmittorn, binder och aktiverar ytan-uttryckte GluRs att kontrollera grundläggande fysiologiska neuronala funktioner såsom synaptisk neurotransmission och synaptisk plasticitet. Det faktum att förändrad GluR-handel har observerats i ett brett spektrum av neuropatier, alltifrån neurologiska utvecklingsstörningar till neurodegenerativa sjukdomar, belyser vikten av denna process5. Att förstå de molekylära händelser som styr GluR-trafficking är därför av intresse för många forskningsområden.
I detta protokoll, en antikropp-utfodring baserad metod används för att kvantifiera nivån på ytan-uttryckta GluRs i primära Hippocampus nervceller samt utvärdera hur förändringar i internalisering och återvinning resultera i den observerade net ytan uttryck. Användning av farmakologi och/eller överuttryck av exogena receptorer härma specifika mutationer gör detta protokoll en särskilt kraftfull metod för att studera molekylära mekanismer bakom neuronala anpassning till olika miljömässiga stimuli. Ett sista exempel på nyttan med detta protokoll är att studera hur multifaktoriella förändringar i miljön (t. ex. i en sjukdoms modell) påverkar GluR-handeln genom undersökning av ytuttryck i sådana modeller.
Med hjälp av specifika exempel, det är initialt visat hur en farmakologisk manipulation imitera fysiologiska synaptisk stimulering [kemisk ltp (cltp)] ökar ytan uttrycket av endogena GluA1 subenhet av AMPA-typ av glurs (ampars) 6. handeln med en överuttryckt Phospho-mimetic form av GluN2B subenhet av NMDA-typ av glurs (nmdars) analyseras också för att exemplifiera hur detta protokoll kan användas för att studera regleringen av Glur-handel med specifika posttranslationella Ändringar. Även om dessa specifika exempel används, detta protokoll kan lätt appliceras på andra GluRs och andra receptorer och proteiner som besitter antigen extracellulära domäner. I det fall att det inte finns några antikroppar tillgängliga för extracellulära domäner, överuttryck av extracellulära Epitope-märkta (t. ex., flagga-, MYC-, GFP-märkta, etc.) proteiner kan bistå i protein märkning.
Det nuvarande protokollet innehåller anvisningar för att kvantifiera specifik GluR subtypdensitet och människohandel med hjälp av specifika antikroppar. Detta protokoll kan utnyttjas för att studera 1) totalt GluR ytuttryck, 2) GluR Internalization, och 3) GluR återvinning. För att studera varje enskild process bör man börja med avsnitten 1 och 2 och fortsätta med antingen avsnitt 3, 4 eller 5. I samtliga fall, avsluta med avsnitten 6 och 8 (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Cellulära svar på yttre stimuli är starkt beroende av den uppsättning av receptorer som uttrycks på cellytan vid en given tidpunkt. Följaktligen är befolkningen i ytan-uttryckta receptorer ständigt anpassar sig och omfattas av strikta mekanismer för reglering. Det paradigmatiska exemplet och en av de mest studerade människohandel händelserna i biologi är den reglerade kontrollen av det synaptiska uttrycket av glutamatreceptorer (GluRs). GluRs förmedlar de allra flesta excitatoriska neurotransmission i centralanervsystemet och kontrollera fysiologiska aktivitet-beroende funktionella och strukturella förändringar på Synaptic och neuronala nivåer (t. ex., synaptisk plasticitet). Ändringar i antal, plats och subenhet sammansättning av ytan uttryckt glurs påverkar djupt neuronala funktion och, i själva verket, förändringar i dessa faktorer är förknippade med olika neuropatier. Presenteras här är en metod för att studera GluR trafficking i dissocierade Hippocampus primära nervceller. En "antikropps matning" metod används för att Differentiellt visualisera GluR populationer uttrycks på ytan och inre membran. Genom att märka ytan receptorer på levande celler och fastställa dem vid olika tidpunkter för att möjliggöra receptorer endocytos och/eller återvinning, dessa människohandel processer kan utvärderas och selektivt studeras. Detta är ett mångsidigt protokoll som kan användas i kombination med farmakologiska metoder eller överuttryck av förändrade receptorer för att få värdefull information om stimuli och molekylära mekanismer som påverkar GluR-handeln. På samma sätt, det kan lätt anpassas för att studera andra receptorer eller ytan uttrycks proteiner.

Detta protokoll för att studera handel med glutamatreceptorer bygger på differential märkning av receptorer uttryckta på cellytan och de som uttrycks i inre membran. Segregering uppnås genom märkning receptorerna före och efter membran permeabilization, med samma primära antikropp men en sekundär antikropp konjugerat till en annan fluorophore. I enlighet med de frivilliga åtgärder som ingår i protokollet är detta en mycket mångsidig metod för förhör av olika processer fö...

Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Den här artikeln presenterar en metod för att studera handel med glutamatreceptorer (GluR) i dissocierade primära Hippocampus kulturer. Med hjälp av en metod för antikropps matning för att märka endogena eller överuttryckta receptorer i kombination med farmakologiska metoder, möjliggör denna metod identifiering av molekylära mekanismer som reglerar GluR-ytans uttryck genom att modulera processer för internalisering eller återvinning.

En antikropps matning metod för att studera glutamat-Receptorhandel i dissocierade primära hippocampal kulturer

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Cellular svar på externa stimuli starkt förlita sig på den uppsättning proteiner som uttrycks på cellytan i ett givet ögonblick. Följaktligen är antalet, sub-cellulära lokalisering, och subenhet sammansättning av dessa proteiner dynamiskt kontrolleras. Här kommer vi att använda en antikroppsmatningsmetod för att kvantifiera nivån av ytan uttryckta receptorer i cellkulturer, så länge internaliseringen och återvinningen återupptas.Detta är ett mycket mångsidigt protokoll, som ger mekanistisk information om reglering av yta uttryckta proteiner. I vårt exempel kommer vi att studera glutaminreceptorer i primära hippocampus nervceller. Detta protokoll kan anpassas till alla protein som har en anagenic extracellulära epitope, om antikroppar inte är tillgängliga, transvection av taggade konstruktioner kan vara användbart för både märkning och studera specifika mutationer.I våra exempel använder vi antikroppar mot endogena GluA1, och taggade Glu12 B.To börja detta förfarande, överföra locket glider cellsidan upp till en paraffinfilm omfattas facket, för att spara reagenser, och underlätta manipulation. Spara och underhåll konditionerat media vid 37 grader Celsius för inkubering och tvättsteg. Inkubera cellerna med primära antikroppar utspädda i konditionerat medium, vid rumstemperatur, i 15 minuter.Efter detta, använd en vakuumpipett för att noggrant aspirera bort antikroppen som innehåller media, och tvätta cellerna tre gånger med konditionerat media. Om studera yta kontra intracellulär receptor uttryck fixa cellerna med paraformaldehyd efter detta steg, som beskrivs i textprotokollet. Underhåll cellerna i konditionerade medier utan antikroppar, och returnera dem till inkubatorn vid 37 grader Celsius för att möjliggöra internalisering.Om du studerar internaliseringsprocessen, fixerar du cellerna med paraformaldehyd efter detta steg, som det skisseras i textprotokollet. För att blockera epitoperna på den primära antikroppen som är fäst vid ytan uttryckta receptorer som inte har internaliserats, inkubera celler med oskadade Fab anti-IgG antikroppsfragment utspädd i konditionerat medium, under 20 minuter vid rumstemperatur. Efter detta tvättar du cellerna tre gånger med konditionerat media.Inkubera de tvättade brunnarna med konditionerade medier som innehåller 80 mikromolar Dynasore, vid 37 grader Celsius, för att möjliggöra återvinning av internaliserade receptorer. Efter avslutad ändringar på levande celler, tvätta cellerna en gång med PBS plus. Tillsätt en lösning på 4%paraformaldehyd och 4%sackaros i PBS till cellerna, och inkubera i en rökhuva vid rumstemperatur i sju till åtta minuter, för att fixera cellerna.Tvätta sedan cellerna tre gånger med vanlig PBS. Tillsätt en lösning på 10%Normal Goat Serum i PBS till cellerna, och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter, för att blockera ospecifika bindningsställen. Därefter inkubera cellerna med fluorescerande taggade sekundära antikroppar utspädd i 3%NGS i PBS vid rumstemperatur i en timme, att märka primära antikroppsetikett receptorer.Efter detta tvättar du cellerna tre gånger med PBS. För att börja märka de intracellulära receptorerna, tillsätt en lösning på 0,25%TritonX i PBS, och inkubera vid rumstemperatur i fem till 10 minuter, för att permeabilisera cellerna. Blockera sedan med 10%NGS i rumstemperatur i 30 minuter.Om studera yta kontra totalt, inkubera cellerna med samma primära antikropp som använts tidigare, utspädd med 3%NGS i PBS, vid rumstemperatur i en timme, för att märka de intracellulära receptorerna. Därefter tvättar du cellerna tre gånger med PBS. Etikett med andra fluorescerande taggade sekundära antikropp, utspädd i 3%NGS i PBS, vid rumstemperatur i en timme.Efter detta tvätta cellerna tre gånger med PBS. Placera först täckluckan snedsteg, cellsidan nedåt, på 12 till 15 mikroliter av lämpligt monteringsmedia för att montera cellerna. Sedan avbilda cellerna på lämplig konfokalmikroskop, och analysera cellerna som beskrivs i textprotokollet.Detta protokoll för att studera glutamatreceptorhandel baseras på differentiell märkning av receptorer, uttryckt vid cellytan, och de som uttrycks i inre membran. Efter att ha förvärvat konfokala bilder, fluorescerande signalen kan lätt kvantifieras för att visa en ökning av ytan uttryck, i förhållande till intracellulära befolkningen, efter kemiska LTP. Ingen signal för PSD-95 kan erhållas i icke-permeabiliserade celler, vilket visar integriteten hos plasmamembranet.Detta indikerar att signalen som erhålls för yta GluA1 verkligen motsvarar yta uttryckt receptorer. Viktigt, en minimal signal för internaliserad GluA1 kan observeras under icke-permeabilisering villkor, visar att alla ytan epitopes är upptagna av den inledande omgången av antikropp märkning. Receptorer som har internaliserats identifieras sedan.Detta exempel belyser att GluN2B fosforylering vid S1480 främjar receptor internalisering. Som fosphomimetic mutant S1480E visas en mycket högre internalisering förhållande jämfört med vilda receptorer. Som förväntat erhålls ingen signal för internaliserade receptorer i kontrollen.Därefter identifieras återvunna receptorer och internaliserade receptorer. Den genererade återvinningskvoten visar att GluN2B S1480E inte har någon effekt på NMDAR-återvinning. I kontrollen kan en stark signal observeras för yta uttryckt GluN2B i avsaknad av Fab blockering.Denna signal försvinner i Fab-behandlade kulturer, vilket visar att blockeringsprotokollet är tillräckligt för att helt blockera ytan uttryckta epitopes, och att de ytsignaler som observerats efter återvinning verkligen motsvarar receptorer som trafikeras tillbaka till plasmamembranet. Det nuvarande protokollet är bara en av de metoder som finns för att studera reglering av ytan uttryckta proteiner. Andra tillvägagångssätt kan vidtas för att expandera eller verifiera de data som erhålls här.Dessa inkluderar biokemiska metoder, som biotinylering, livsbildande tekniker, eller funktionella metoder, som elektrofysiologi eller kalciumavbildning. Vi använder PFA för att frysa lokalisering av receptorer, men PFA är en känd cancerframkallande, så det är viktigt att utföra steg med PFA under en rök huva, samtidigt bär lämplig personlig skyddsutrustning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic hippocampus Slice kulturer

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Membranpotential Dye avbildning av ventromediala Hypothalamus nervceller från vuxna möss för att studera Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Med hjälp av en α-bungarotoxinbindning Site Tag att studera GABA A-receptorn Membran Lokalisering och människohandel

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Den Analys av neurovaskulär Remodeling i Entorhino-hippocampus Organotypic Slice kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Rand analys för att studera Attraktiv eller frånstötande aktivitet av en proteinsubstrat Använda Dissocierad hippocampus nervceller

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-density Primary hippocampus Neuron kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hippocampus Slice kulturer som en modell att studien neuroprotektion och invasivitet av tumörceller

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...