Name: an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

Nikon a1 Confocal mikroskop ve deneyler planlama ve analiz yardım onların kullanımı için Northwestern gelişmiş Microkopi merkezi teşekkür ederiz. Bu araştırma (T32GM008061) (A. M. C), ve NIA (R00AG041225) ve Brain & davranış Araştırma Vakfı (#24133) (A. S.-C.) bir NARSAD genç araştırmacı Grant tarafından desteklenmektedir.

Hipokampal İlköğretim kültürü hazırlığı ile ilgili çalışmalar Northwestern Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (protokol #IS00001151) tarafından incelendi ve onaylanmıştır.
1. etiketleme öncesi hazırlık
<ol><li>
Primer hipokampal kültürlerin hazırlanması ve Bakımı
	<ol>
<li>Primer hipokampal kültürlerini Poly-D-lizin kaplı (0,1 mg/mL) 18 mm kapak gözlüklerinde kaplama 150.000 hücrelerin yoğunluğunda hazırlayın. Dissosyated ...

<ol>
	<li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways.">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).</li><li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity.">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li><li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+(NMDA)+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+(AMPA)+Receptors+by+Posttranslational+Modifications.">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons.">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition:+Many+Regulators,+Many+Consequences.">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation.">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient.">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li><li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures.">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li><li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials.">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).</li></ol>

Bir hücre ile çevre arasındaki etkileşim (örn. diğer hücrelerle iletişim, farklı uyaranlara yanıt vb.), hücre yüzeyinde reseptörlerin doğru ifadesine ağır dayanır. Yüzeydeki hızlı ve ince ayarlı düzenleme reseptör içeriği sürekli değişen bir ortama uygun hücresel yanıt sağlar. Nöronlar belirli durumda, sayı, yerelleştirme ve synaptically ifade reseptörlerinin alt bileşiminde değişiklikler ağır sinaptik iletişim etkiler, sinaptik plastisite, synaptogenit, ve sinaptik budama<sup cla...

Hücreler, proteinleri belirli alt hücresel lokalize olarak seferber etmek ve fonksiyonları1üzerinde sıkı bir mekan düzenlemesi yapmak için aktif ticaretini kullanır. Bu süreç özellikle transmembran reseptörleri için önemlidir, farklı çevresel uyaranlara hücresel tepkiler reseptör aktivasyonu ile tetiklenen hücre içi Cascades güveniyor gibi. Hücreler reseptör hücre altı ticareti düzenleme2ile hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin yoğunluğu, lokalizasyonu ve alt birim bileşimi değiştirerek bu yanıtları değiştirebilir. Yeni sentezlenmiş reseptörlerin plazma membranı içine yerleştirilmesi, endositoz ve mevcut reseptörlerin geri dönüşümünün yanı sıra yüzey-ifade reseptörlerinin net havuzunu belirleyen kaçakçılık süreçlerine örnektir2. Protein kaçakçılığı düzenleyen birçok Moleküler mekanizma işbirliği, proteinli protein etkileşimleri ve fosforilasyon, ubiquitination gibi posttranslasyonel modifikasyonlar, veya palmitoyasyon2.
Reseptör kaçakçılığının düzenlenmesi özellikle çok özel yapılarla güçlü polarize hücrelerde gereklidir. Paradigmatik örnek glutamat reseptörleri (glurs)3,4düzenlenmiş ticareti ile nöronal fonksiyon kontrolü. Glutamat, ana uyarıcı nörotransmitter, bağlar ve yüzey-ifade GluRs sinaptik nörotransmisyon ve sinaptik plastisite gibi temel fizyolojik nöronal fonksiyonları kontrol etmek için etkinleştirir. Nöro-gelişimsel bozukluklardan nörodejeneratif hastalıklara kadar uzanan geniş bir nöropati yelpazesinde GluR kaçakçılığı değiştirildiği gerçeğini bu sürecin5' in önemini vurgulamaktadır. Böylece, GluR kaçakçılığı kontrol eden moleküler olayların anlaşılması araştırma birçok alanda ilgi olduğunu.
Bu protokolde, primer hipokampal nöronların yüzey seviyesinin ölçülmesi için antikor beslemeli bir yöntem kullanılır, aynı zamanda ınterpralization ve geri dönüşümdeki değişikliklerin gözlenen net yüzey ifadesinde nasıl sonuçlanduğunu değerlendirebilirsiniz. Spesifik mutasyonları kullanan eksojen reseptörlerin farmakolojisinin ve/veya aşırı ifadesinin kullanımı, bu protokol, farklı çevresel uyaranlara nöronal adaptasyon temelindeki moleküler mekanizmaları incelemek için özellikle güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu protokolün son örneği, ortamda (örneğin, bir hastalık modelinde), bu tür modellerde yüzey ifadesinin incelenmesi yoluyla GluR kaçakçılığı etkilemesi konusunda ne kadar multifokal değişiklikler yapılacağını okuyor.
Belirli örnekler kullanarak, başlangıçta fizyolojik sinaptik stimülasyon taklit bir farmakolojik manipülasyon nasıl gösterilmiştir [kimyasal LTP (cltp)] AMPA-glurs tipi (ampars) endojen GluA1 altbirim yüzey ifadesi artar 6. NMDA-türü glurs (nmdars) GluN2B altbirim bir aşırı ifade fosho-mimetic formu ticareti de bu protokol belirli posttranslasyonel tarafından Glur kaçakçılığı düzenlenmesi çalışmak için nasıl kullanılabilirler örnek olarak analiz edilir Değişiklik. Bu özel örnekler kullanılsa da, bu protokol diğer GluRs ve diğer reseptörlere ve antijenik hücre dışı alanlara sahip olan proteinler için kolayca uygulanabilir. Hücre dışı alanlar için mevcut antikorlar olmadığı durumda, ekstrelüler epitope etiketli (örn., bayrak-, MYC-, GFP-Tagged, vb.) proteinleri protein etiketlemeye yardımcı olabilir.
Geçerli protokol, spesifik antikorlar kullanarak belirli GluR alt tipi yoğunluğunu ve kaçakçılığı ölçmek için yönergeler sağlar. Bu protokol 1) Toplam GluR yüzey ifadesi, 2) GluR etilleştirme ve 3) GluR geri dönüşümü için kullanılabilir. Her bir işlemi bireysel olarak incelemek için 1 ve 2 bölümlerle başlamak ve 3, 4 veya 5 bölümüne devam etmeniz önerilir. Her durumda, 6 ve 8 bölümlerle bitir (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm dia. #1.5 thick coverglasses</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG181.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynasore</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB3700970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GluA1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco BioWave</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD-95 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an antibody feeding approach to study glutamate receptor trafficking in dissociated primary hippocampal cultures

Harici uyaranlara hücresel tepkiler ağır belirli bir anda hücre yüzeyinde ifade reseptörleri kümesine güveniyor. Buna göre, yüzey tarafından ifade edilen reseptörlerin nüfusu sürekli uyarlama ve sıkı düzenleme mekanizmalarına tabidir. Paradigma örneği ve biyolojideki en çok araştırılan kaçakçılık olaylarından biri de glutamat reseptörlerinin (GluRs) sinaptik ifadesinin denetlendiği kontrolidir. GluRs, sinaptik ve nöronal düzeylerde (örneğin, sinaptik plastisite), merkezi sinir sisteminde uyarıcı nörotransmisyon büyük çoğunluğu arabulucu ve fizyolojik aktivite bağımlı fonksiyonel ve yapısal değişiklikler kontrol. Yüzeydeki sayı, konum ve alt birim bileşiminde yapılan değişiklikler, GluRs 'un nöronal fonksiyonları derinden etkilediğini ve aslında bu faktörlerde yapılan değişiklikler farklı nöropati ile ilişkilidir. Burada sunulan, disanated hipokampal primer nöronlar GluR ticareti incelemek için bir yöntemdir. "Antikor-besleme" yaklaşımı, yüzey ve iç membranlarda ifade edilen GluR nüfusunun farklılaşarak görselleştirilmesi için kullanılır. Yüzey reseptörlerini canlı hücrelerde etiketleme ve reseptörlere endositoz ve/veya geri dönüşüm için izin vermek için farklı zamanlarda sabitleme, bu kaçakçılık süreçleri değerlendirilebilir ve seçici olarak incelenebilir. Bu, GluR kaçakçılığı etkileyen uyarıcı ve moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler elde etmek için değiştirilmiş reseptörlerin farmakolojik yaklaşımlar veya aşırı ifade edilmesi ile birlikte kullanılabilecek çok yönlü bir protokoldür. Benzer şekilde, diğer reseptörleri veya yüzey ifade proteinleri çalışmak için kolayca adapte edilebilir.

Glutamat reseptör kaçakçılığı incelemek için bu protokol hücre yüzeyinde ifade reseptörleri diferansiyel etiketleme dayanmaktadır ve bu iç membranlarda ifade. Ayrım önce ve membran geçirmezlik sonra reseptörleri etiketleme tarafından elde edilir, aynı primer antikor ancak farklı bir fluorophore konjuate ikincil bir antikor kullanarak. Protokol dahil isteğe bağlı adımlarla özetlendiği gibi, bu, farklı reseptör kaçakçılığı süreçleri sorgulamak için çok ...

Watch this Scientific Journal Video about An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures at JoVE.com

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Dış uyaranlara hücresel tepkiler ağır belirli bir anda hücre yüzeyinde ifade edilen proteinlerin kümesine bağlıdır. Buna göre, bu proteinlerin sayısı, alt hücresel lokalizasyonu ve alt birim bileşimi dinamik olarak kontrol edilir. Burada, hücre kültürlerinde ifade edilen reseptörlerin seviyesini ölçmek için bir antikor besleme yaklaşımı kullanacağız, sürece içselleştirme ve geri dönüşüm devam eder.Bu çok yönlü bir protokoldür, yüzey ifade proteinlerin düzenlenmesi mekanik bilgi sağlar. Örneğimizde, primer hipokampal nöronlarda glutamin reseptörlerini inceeceğiz. Bu protokol, anajenik ekstrasellüler epitopa sahip herhangi bir proteine uyarlanabilir, eğer antikorlar yoksa, etiketli yapıların transveksiyonu hem etiketleme hem de spesifik mutasyonların incelenmesi için yararlı olabilir.Örneklerimizde, endojen GluA1'e karşı antikorlar kullanıyoruz ve bu prosedürü B.To glu12 etiketli, kapak pilini parafin film kaplı tepsiye aktarıyoruz, reaktifleri kurtarıyoruz ve manipülasyonu kolaylaştırıyoruz. Kuluçka ve yıkama adımları için 37 santigrat derecede koşullandırılmış ortam kaydedin ve bakımını koruyun. Hücreleri, şartlı ortamda, oda sıcaklığında seyreltilmiş birincil antikorlarla 15 dakika kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, ortam içeren antikorları dikkatlice aspire etmek için bir vakum pipet kullanın ve hücreleri şartlı ortamla üç kez yıkayın. Eğer yüzey ve hücre içi reseptör ekspresyonu inceleniyorsa, metin protokolünde belirtildiği gibi, bu adımdan sonra hücreleri paraformaldehit ile düzeltin. Hücreleri antikorsuz koşullu ortamda koruyun ve içselleştirmeye olanak sağlamak için 37 derecede kuvöze geri verin.İçselleştirme işlemini inceliyorsanız, metin protokolünde belirtildiği gibi, bu adımdan sonra hücreleri paraformaldehit ile düzeltin. Yüzeye bağlı birincil antikor üzerinde epitops bloke etmek için içselleştirilmemiş reseptörleri ifade reseptörleri ifade, konjuge edilmemiş Fab anti-IgG antikor parçaları ile inkübat hücreleri şartlı ortamda seyreltilmiş, oda sıcaklığında 20 dakika. Bundan sonra hücreleri şartlı ortamla üç kez yıkayın.İçselleştirilmiş reseptörlerin geri dönüştürülmesine olanak sağlamak için yıkanmış kuyuları 37 derecede 80 mikromolar Dinamo içeren klimalı ortamla inkübe edin. Canlı hücrelerdeki modifikasyonları tamamladıktan sonra hücreleri pbs artı ile bir kez yıkayın. Hücrelere PBS'de %4 paraformaldehit ve %4 sakaroz çözeltisi ekleyin ve hücreleri düzeltmek için oda sıcaklığında yedi ila sekiz dakika boyunca bir duman kaputunda kuluçkaya yatırın.Sonra hücreleri normal PBS ile üç kez yıkayın. PBS'deki %10 Normal Keçi Serumu çözeltisini hücrelere ekleyin ve spesifik olmayan bağlama bölgelerini engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, primer antikor etiket reseptörlerini etiketlemek için, oda sıcaklığında PBS'de %3 NGS'de seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikorlu hücreleri bir saat boyunca kuluçkaya yatırın.Bundan sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücre içi reseptörleri etiketlemeye başlamak için, PBS'de %0.25 TritonX çözeltisi ekleyin ve hücreleri permeabilize etmek için 5 ila 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sonra 30 dakika oda sıcaklığında% 10 NGS ile blok.Yüzey ve total üzerinde çalışıyorsanız, hücre içi reseptörleri etiketlemek için, pbs%3 NGS ile seyreltilmiş, bir saat oda sıcaklığında, daha önce kullanılan aynı birincil antikor ile hücreleri kuluçka. Daha sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. PBS'de %3 NGS'de seyreltilmiş ikinci floresan etiketli ikincil antikorlu etiket, oda sıcaklığında bir saat süreyle.Bundan sonra pbs ile hücreleri üç kez yıkayın. Önce kapak fişleri yavaşça yerleştirin, hücre tarafı aşağı, hücreleri monte etmek için uygun montaj ortamının 12 ila 15 mikrolitre. Daha sonra hücreleri uygun konfokal mikroskopta görüntüleyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi hücreleri analiz edin.Glutamat reseptör ticaretini inceleyen bu protokol, hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin ve iç zarlarda ifade edilen lerin diferansiyel etiketlemesine dayanmaktadır. Konfokal görüntüleri elde ettikten sonra, floresan sinyal kolayca yüzey ekspresyonunda bir artış göstermek için ölçülebilir, hücre içi nüfusa göre, kimyasal LTP aşağıdaki. Plazma zarının bütünlüğünü gösteren, permeabilize olmayan hücrelerde PSD-95 için sinyal alınamaz.Bu, glua1 yüzeyi için elde edilen sinyalin gerçekten yüzey ifade reseptörlerine karşılık geldiğini gösterir. Daha da önemlisi, içselleştirilmiş GluA1 için minimum sinyal, tüm yüzey epitoplarının antikor etiketlemenin ilk turu tarafından işgal edilmiş olduğunu gösteren, permeabilizasyon olmayan koşullar altında gözlemlenebilir. Daha sonra içselleştirilmiş reseptörler tanımlanır.Bu örnek, S1480'deki GluN2B fosforilasyonun reseptör içselleşmesini desteklediğini vurgulamaktadır. Fosfomimetik mutant S1480E yabani tip reseptörlere göre çok daha yüksek bir içselleştirme oranı gösterdi. Beklendiği gibi, kontrolde içselleştirilmiş reseptörler için sinyal elde edilir.Daha sonra, geri dönüşümlü reseptörler ve içselleştirilmiş reseptörler tanımlanır. Oluşturulan geri dönüşüm oranı, GluN2B S1480E'nin NMDAR geri dönüşümü üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir. Kontrolde, Fab engelleme yokluğunda glun2B ifade yüzey için güçlü bir sinyal görülebilir.Bu sinyal Fab-tedavi kültürlerde kaybolur, engelleme protokolü tamamen yüzey imal epitopsblok için yeterli olduğunu gösteren, ve geri dönüşüm den sonra gözlenen yüzey sinyalleri gerçekten plazma membran geri ticareti reseptörlerine karşılık gelir. Mevcut protokol, yüzeyifade edilen proteinlerin düzenlenmesini incelemek için kullanılan yöntemlerden sadece biridir. Burada elde edilen verileri genişletmek veya doğrulamak için başka yaklaşımlar da alınabilir.Biyosonyum, yaşam görüntüleme teknikleri veya elektrofizyoloji veya kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel yaklaşımlar gibi biyokimyasal yöntemler bunlardır. Biz reseptörlerin lokalizasyondondurmak için PFA kullanın, Ancak PFA bilinen bir karsinojen, bu yüzden uygun PPE giyerken, bir duman başlık altında PFA kullanarak adımları gerçekleştirmek için çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Çizgili Deneyi Disosiye Hipokampal Nöronlar kullanarak Protein Substrat çekici veya itici Aktivite Eğitim için

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...