Name: murine cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique
Uploaded: 2019-11-02T13:00:00
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Tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo le linee guida del German Animal Welfare Act (TierSchG.) 55,2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).
1. Alloggi per animali
<ol><li>Per gli esperimenti, utilizzare topi maschi C57BL/6 e BALB/c del peso di 20-25 g con topi C57BL/6 come animali ricitati e topi BALB/c come animali donatori.</li>
	<li>Acquistare gli animali e la casa in una barriera senza agenti patogeni, in conformità con le linee guida FELASA per il monitoraggio sanitario<sup class="xre...

<ol>
	<li>Rana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+benefit+of+solid-organ+transplant+in+the+United+States.">Survival benefit of solid-organ transplant in the United States.</a> JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).</li><li>Rana, A., Godfrey, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+in+Solid-Organ+Transplantation:+Success+and+Stagnation.">Outcomes in Solid-Organ Transplantation: Success and Stagnation.</a> Texas Heart Institute Journal. 46 (1), 75-76 (2019).</li><li>Meier-Kriesche, H. U., Schold, J. D., Srinivas, T. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medication+management+of+cardiac+allograft+vasculopathy+after+heart+transplantation.">Medication management of cardiac allograft vasculopathy after heart transplantation.</a> Pharmacotherapy. 35 (5), 489-501 (2015).</li><li>Verleden, G. M., Raghu, G., Meyer, K. C., Glanville, A. R., Corris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+classification+system+for+chronic+lung+allograft+dysfunction.">A new classification system for chronic lung allograft dysfunction.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (2), 127-133 (2014).</li><li>Ramzy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+allograft+vasculopathy:+a+review.">Cardiac allograft vasculopathy: a review.</a> Canadian Journal of Surgery. 48 (4), 319-327 (2005).</li><li>Skoric, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+allograft+vasculopathy:+diagnosis,+therapy,+and+prognosis.">Cardiac allograft vasculopathy: diagnosis, therapy, and prognosis.</a> Croatian Medical Journal. 55 (6), 562-576 (2014).</li><li>Koulack, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+mouse+aortic+transplant+model+of+chronic+rejection.">Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection.</a> Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).</li><li>Rowinska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Sleeve+Technique+in+a+Mouse+Model+of+Aortic+Transplantation+-+An+Instructional+Video.">Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video.</a> Journal of Visualized Experiments. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1/CXCR4/CXCR7+is+pivotal+for+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+chronic+allograft+vasculopathy.">SDF-1/CXCR4/CXCR7 is pivotal for vascular smooth muscle cell proliferation and chronic allograft vasculopathy.</a> Transplant International. 28 (12), 1426-1435 (2015).</li><li>Ollinger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilirubin:+a+natural+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.">Bilirubin: a natural inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation.</a> Circulation. 112 (7), 1030-1039 (2005).</li><li>Segura, A. M., Buja, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+allograft+vasculopathy:+a+complex+multifactorial+sequela+of+heart+transplantation.">Cardiac allograft vasculopathy: a complex multifactorial sequela of heart transplantation.</a> Texas Heart Institute Journal. 40 (4), 400-402 (2013).</li><li>McDaid, J., Scott, C. J., Kissenpfennig, A., Chen, H., Martins, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+animal+models+in+developing+immunosuppressive+agents.">The utility of animal models in developing immunosuppressive agents.</a> European Journal of Pharmacology. 759, 295-302 (2015).</li><li>Shi, C., Russell, M. E., Bianchi, C., Newell, J. B., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+accelerated+transplant+arteriosclerosis.">Murine model of accelerated transplant arteriosclerosis.</a> Circulation Research. 75 (2), 199-207 (1994).</li><li>Koulack, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+minor+histocompatibility+antigens+in+the+development+of+allograft+arteriosclerosis.">Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis.</a> Clinical Immunology and Immunopathology. 80 (3 Pt 1), 273-277 (1996).</li><li>Maglione, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+heterotopic+vascularized+pancreas+transplantation+in+mice+to+assess+ischemia+reperfusion+injury+and+graft+pancreatitis.">A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis.</a> Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).</li><li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cervical+heart+transplantation+model+using+a+modified+cuff+technique.">Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).</li><li>Nakao, A., Ogino, Y., Tahara, K., Uchida, H., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+intestinal+transplantation+using+the+cuff+method+in+rats:+a+histopathological+evaluation+of+the+anastomosis.">Orthotopic intestinal transplantation using the cuff method in rats: a histopathological evaluation of the anastomosis.</a> Microsurgery. 21 (1), 12-15 (2001).</li></ol>

La vasculopatia allotrapianto cronica è la causa principale della perdita tardiva dell'innesto dopo il trapianto di organi solidi del cuore e probabilmente allotrapianti renali e polmonari8. Finora, non è stato possibile sviluppare alcun regime terapeutico causale al fine di prevenire la formazione di CAV.
La fisiofisiologia del CAV è multifattoriale e coinvolge gli aspetti immunologici e non immunologici16. L'uso di modelli di roditori nei tr...

Negli ultimi sei decenni, il trapianto di organi solidi si è evoluto da una procedura sperimentale a uno standard di cura per il trattamento del fallimento dell'organo allo stadio finale1. A causa del miglioramento degli agenti antimicrobici, delle tecniche chirurgiche e dell'avanzamento nei reggimenti immunosoppressivi, il tasso di successo precoce del trapianto di organi solidi è aumentato significativamente negli ultimi decenni2.
Tuttavia, i tassi di sopravvivenza all'innesto a lungo termine non sono migliorati in modo significativo nello stesso modo3. Lo sviluppo di CAV è il principale fattore che limita la sopravvivenza a lungo termine4,5,6. Questa patologia è caratterizzata dalla formazione di uno strato neointimale concentrico costituito da cellule muscolari lisce, che porta al progressivo restringimento del vaso e alla perffusione consecutiva dell'organo solido trapiantato. Nei pazienti trapiantati di cuore, le lesioni CAV possono essere diagnosticate in fino al 75% dei pazienti 3 anni dopo il trapianto7.
La fisiofisiologia del CAV non è ancora del tutto compresa. Sembra essere correlato a numerosi fattori immunologici e non immunologici, che portano a danni endoteliali con conseguente attivazione endoteliale e disfunzione8. Finora non esiste alcuna opzione di trattamento causale per la prevenzione del CAV, sottolineando la necessità di un modello animale piccolo riproducibile al fine di studiare la formazione e la potenziale terapia del CAV.
Con l'uso di modelli di trapianto aortico murino, CAV come lesioni può essere visto 4 settimane dopo il trapianto. Queste lesioni sono costituite principalmente da cellule muscolari lisce vascolari, in tal modo, simile alla patologia umana. A causa di un'ampia varietà di topi transgenici e abbattuti, l'uso di modelli murini nelle patologie associate al trapianto offre un'opportunità unica per identificare nuove opzioni terapeutiche e comprenderne lo sviluppo. A causa del piccolo diametro dei vasi trapiantati, tuttavia, l'uso di modelli murini è comunemente associato a lunghe curve di apprendimento e un alto tasso di complicanza iniziale9. Con l'introduzione della tecnica del bracciale non-sutura, questa parte più impegnativa dell'operazione può essere facilitata e il diametro dell'anastomosi è mantenuto costante10,11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balb-c Mice (H2-d)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain# 028</td>
			<td>Donor animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar cautery system</td>
			<td>ERBE</td>
			<td>ICC 50 / 20195-023</td>
			<td>Bipolar cautery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (H-2b)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain# 027</td>
			<td>Recipient animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12501-12</td>
			<td>Needle Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Forceps</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td>BH111R</td>
			<td>Curved Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Polyimide Tubing</td>
			<td>Nordson MEDICAL</td>
			<td>141-0031</td>
			<td>Cuff-Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Serrefines</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
			<td>Micro Vessel Clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td>Standard Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
			<td>Clipapplicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45&#176;)</td>
			<td>S&#38;T</td>
			<td>00649-11</td>
			<td>Fine Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Vessel Dilating Forceps - Angled 10&#176; (Tip diameter 0.2 mm)</td>
			<td>S&#38;T</td>
			<td>00125-11</td>
			<td>Vesseldilatator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott VisiLED Set</td>
			<td>Schott</td>
			<td>MC 1500 / S80-55</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11 / 14001-12</td>
			<td>Standard Sissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm)</td>
			<td>FST</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Microsissors (curved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm)</td>
			<td>FST</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>Microsissors (straight)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique

Con l'introduzione di potenti protocolli immunosoppressivi, sono possibili progressi distinti nella prevenzione e nella terapia degli episodi di rigetto acuto. Tuttavia, negli ultimi decenni si è potuto osservare solo un lieve miglioramento dei risultati a lungo termine degli organi solidi trapiantati. In questo contesto, la vasculopatia cronica allotrapianto (CAV) rappresenta ancora la principale causa di insufficienza di organi tardiva nel trapianto cardiaco, renale e polmonare.
Finora, la patogenesi di fondo dello sviluppo di CAV rimane poco chiara, spiegando perché attualmente mancano strategie di trattamento efficaci e sottolineando la necessità di modelli sperimentali pertinenti al fine di studiare la fisiopatologia sottostante che porta a formazione di CAV. Il seguente protocollo descrive un modello di trapianto aortico cervicale eterotopico murno utilizzando una tecnica di polsino non sutura modificata. In questa tecnica, un segmento dell'aorta toracica è interposto nella giusta arteria carotide comune. Con l'uso della tecnica del bracciale non-sutura, è possibile stabilire un modello facile da imparare e riproducibile, riducendo al minimo la possibile eterogeneità delle microantomosi vascolari suturate.

Nel modello di trapianto completamente MHC-mismatch, uno strato neointimale concentrico può essere visto 4 settimane dopo il trapianto (Figura 2). Questo strato è costituito principalmente da cellule muscolari limpiche vascolari come colorazione immunoistologica per SM22 (un marcatore selettivo per le cellule muscolari lisce vascolari mature) rivelato. Come detto prima, queste cellule muscolari lisce vascolari sono patognominiche per le lesioni osservate nella vascolata cronica allotrapian...

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Murine Cervical Aortic Transplantation Model using a Modified Non-Suture Cuff Technique

Qui, presentiamo un protocollo di trapianto aortico eterotopico nei topi utilizzando la tecnica del bracciale non-suture in un modello di murino cervicale. Questo modello può essere utilizzato per studiare la patologia sottostante della vasculopatia allotrapianto cronica (CAV) e può aiutare a valutare nuovi agenti terapeutici al fine di prevenirne la formazione.

Modello di trapianto aortico cervicale murine utilizzando una tecnica di manette non sutura modificata

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. ...

Sono Martin Ryll dei laboratori di ricerca del Dipartimento di Chirurgia Generale, Viscerale e Trapiantata dell'LMU di Monaco. Oggi vi mostreremo un modello di trapianto aortico eterotopico murino utilizzando una tecnica di polsino non sutura modificata. In primo luogo, anestetizzare l'animale ricevente con un'iniezione intraperitoneale di midazolam, medetomidina e fentanil.Ritagliare tutti i capelli della regione laterale cervicale con un tagliacapelli elettrico per piccoli animali e applicare un unguento oftalmico con tamponi di cotone per evitare che gli occhi si asciughino durante la procedura. Posizionare l'animale in posizione supina su un riscaldante al microscopio e rastremettere delicatamente le gambe sul tavolo operatorio con strisce di gesso sensibili alla pelle. Inclinare la testa all'indietro e pulire il campo operatorio più volte con alcol.Fai un'incisione cutanea dall'incisione giugulare alla mattiera inferiore destra con piccole forbici. Rimuovere il lobo inferiore destro della ghiandola sottomandibolare tramite cautery bipolare del pedicolo del vaso e successiva escissione con micro forbici. Rimuovere il muscolo sternocleidomastoideo destro tramite cautery bipolare della parte superiore e inferiore e successiva escissione con micro forbici per accedere alla comune arteria carotidea.Mobilitare l'arteria carotide comune il più lontano possibile in modo distale e prossimale separando il tessuto connettivo circostante con forcelle fini. Legare due legature di seta 7-0 con una distanza minima l'una dall'altra intorno al centro della comune arteria carotide e traseleggere la comune arteria carotide con micro forbici fini tra le legature. Passare l'estremità prossimale legata attraverso il polsino e fissarla con un piccolo morsetto dell'arteria.Rimuovere la legatura con micro forbici fini il più vicino possibile alla legatura e sciacquare il lume con soluzione salina eparinizzata con un ago calibro 30 facendo attenzione a non danneggiare le pareti del vaso. Disteso il lume aperto usando dilatatori vascolari fini e invertire il ceppo carotideo sul polsino tirandolo delicatamente sopra il tubo di poliammide. Fissare immediatamente la carotide rovesciata con un anello di seta 7-0 vagamente pre-legato.Eseguire la stessa procedura sull'altra estremità dell'arteria carotide con l'altro polsino. Passare l'estremità legata distale attraverso il polsino e fissarla con un piccolo morsetto arteriosa. Rimuovere la legatura con micro forbici fini il più vicino possibile alla legatura e sciacquare il lume con soluzione salina eparinizzata con un ago calibro 30 facendo attenzione a non danneggiare le pareti del vaso.Disteso il lume aperto usando dilatatori vascolari fini e invertire il ceppo carotideo sul polsino tirandolo delicatamente sopra il tubo di poliammide. Fissare immediatamente la carotide rovesciata con un anello di seta 7-0 vagamente pre-legato. Mettere da parte l'animale ricevente e idratare il due terzi superiore con soluzione salina fino a quando il segmento aortico non viene estiantato.Anestetizza il topo donatore allo stesso modo dell'animale ricevente. Ritagliare tutti i capelli della regione addominale e toracica con un tagliacapelli elettrico per piccoli animali e applicare unguento oftalmico con tamponi di cotone per evitare che gli occhi si asciughino durante la procedura. Posizionare l'animale in posizione supina su un riscaldante al microscopio e rastremettere delicatamente le gambe sul tavolo operatorio con strisce di gesso sensibili alla pelle.Strofinare più volte il campo operatorio con alcol. Eseguire una laparotomia addominale di linea mediana con piccole forbici e spingere leggermente l'intestino verso l'alto per esporre la vena cava inferiore. Iniettare all'IVC un cc di salina eparinata utilizzando un ago calibro 30.Tagliare l'aorta addominale e l'IVC sotto le arterie renali con piccole forbici per esanguinare l'animale donatore. Posizionare liberamente un impacco nell'addome per assorbire il sangue. Eseguire una toracotomia tramite diversione bilaterale delle costole con forbici e inclinare cranialmente la parete anteriore del torace con un morsetto chirurgico per esporre il mediastino.Tagliare l'IVC e l'esofago direttamente sopra il diaframma con micro forbici. Rimuovere il cuore e i polmoni titolandoli verso l'alto con forcep che tengono l'IVC e l'esofago tagliati e quindi li eccitano con micro forbici dalla base per ottenere l'accesso all'aorta toracica e al mediastino dorsale. Mobilitare l'aorta toracica dal tessuto circostante separando il tessuto connettivo circostante e il grasso con forcelle fini, facendo attenzione a non danneggiare le arterie intercostali.Cauterizzare tutti i rami dell'aorta toracica con forcetta cautery bipolare e asportare il segmento aortico tra il diaframma e l'arco aortico usando micro forbici. Sciacquare il segmento aortico asportato con soluzione salina eparinizzata con un ago calibro 30 facendo attenzione a non danneggiare le pareti del vaso per rimuovere il sangue o i coaguli rimanenti e trasferire l'innesto all'animale ricevente. Tirare l'estremità prossimale del segmento aortico donatore sul polsino prossimale sopra l'arteria carotide rovesciata con forcep fini e fissarlo immediatamente con un anello di seta 7-0 vagamente pre-legato.Tagliare l'estremità libera distale dell'innesto aortico con micro forbici in modo che la lunghezza dell'innesto si adatti alla distanza tra i due polsini. Tirare l'estremità distale del segmento aortico donatore sul polsino distale sopra l'arteria carotide rovesciata con forcep fini e fissarlo immediatamente con un anello di seta 7-0 vagamente pre-legato. Rimuovere prima il morsetto distale per consentire la perfusione retrograda.Dopo aver raggiunto l'emostasi, rimuovere il morsetto prossimale per completare l'anastomosi. Infine, chiudere la ferita con 6-0 sutura continua. Dopo 28 giorni, gli animali vengono sacrificati e gli innesti conservati per la colorazione istologica.Come mostrato nelle colorazioni di queste sezioni aortiche di Van-Gieson, gli aorta allografati allografati completamente non corrispondenti da donatori Balb / c a sei destinatari neri hanno sviluppato una significativa iperplasia neointimica con conseguente restringimento luminale. D'altra parte, i trapianti aortici sinogeni da sei donatori neri a sei riceventi neri hanno sviluppato solo poca iperplasia neointimica. La colorazione dell'immunofluorescenza contro SM22, un marcatore per le cellule muscolari lisce vascolari, come mostrato in questa immagine nella fluorescenza verde, dimostra che il neointima consiste principalmente di cellule muscolari lisce vascolari.Il trapianto aortico murino funge da modello per la vasculopatia cronica da trapianto che è la causa più comune di insufficienza dell'innesto tardivo. Rispetto al modello addominale ortotopico, la nostra tecnica del polsino modificato è meno microchirurgica e richiede un alto tasso di successo. Inoltre, a causa del diametro costante del polsino, le variazioni dell'anastomosi vascolare come si vede in altri modelli di trapianto microchirurgico possono essere trascurate.Inoltre, il tempo ischemico caldo viene mantenuto costante in tutti i gruppi sperimentali in quanto l'animale ricevente viene preparato prima che il segmento aortico sia espiantato. Il nostro modello modificato dovrebbe aiutare altri laboratori a stabilire il trapianto aortico murino.

Research

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