Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل JDRF المنح 1-INO-2015-74-S-B، 2-SRA-2016-238-S-B، و SRA-2-S-2018-648-S-B، جائزة التعليم والعمل في مجال مرض السكري، وصندوق كارولين ويس القانوني للبحوث في الطب الجزيئي في كلية بايلور للطب. تم دعم فرز الخلايا من قبل علم الخلايا وخلية فرز الأساسية في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (S10RR024574 و P30CA125123). تم الحصول على جميع رباعيات الببتيد MHC من مرفق نواه رباعي النواة.

تم الحفاظ على الفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في مرفق الماوس المعدلة وراثيا، وأجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها كلية بايلور للرعاية الحيوانية والاستفادة منها لجنة.
ملاحظة: تتطلب التجربة إعداد الفيروس والخلايا T في نفس الوقت. <stron...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لإنتاج خلايا CD8 CAR-T الخاصة بالمستضد عن طريق الانكلب الفيروسي. كفاءة نقل بروتوكولنا عادة عالية، ويلاحظ عموما التعبير القوي عن جمهورية أفريقيا الوسطى. تحتفظ خلايا CAR T الموسعة بالميزات الأساسية للخلايا T التي يتم تنشيطها من قبل الوالدين، وخصوصية الأجسام المضاد...

وبالنظر إلى احتمال انخفاض خطر الآثار غير المرغوب فيها خارج الهدف، فإن العلاجات المناعية الخاصة بالمستضد (ASI) هي علاجات واعدة لأمراض المناعة الذاتية مثل T1D. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الاستجابات المناعية للأنسولين (بريبرو) قد تكون ذات أهمية خاصة في T1D1. في العقد الماضي، والدراسات من مجموعات متعددة، بما في ذلك منطقتنا، تشير بقوة إلى أن تقديم epitope التي تحتوي على الأنسولين B سلسلة الأحماض الأمينية 9 إلى 23 من قبل جزيئات محددة MHC الفئة الثانية (B:9-23/MHCII)، يلعب دورا هاما في تطوير T1D في الفئران والبشر2،3،4،5. لاستهداف مجمع B:9-23/MHCII بشكل انتقائي، قمنا بإنشاء جسم مضاد أحادي النسيلة، اسمه mAb287، ليس لديه تفاعل متقاطع مع هرمون الأنسولين أو المجمعات التي تحتوي على ببتيدات أخرى6. MAb287 كتل عرض مستضد في المختبر، والإدارة الأسبوعية من mAb287 إلى الفئران NOD ما قبل السكري تأخر تطوير T1D في 35٪ من الفئران المعالجة6. لمنع عرض مستضد في الجسم الحي, وعادة ما تكون هناك حاجة إلى الحقن المتكررة من أجل الحفاظ على تركيز تعميم عالية. افترضنا أننا يمكن التغلب على هذه الصعوبة من خلال الاستفادة من خصوصية عالية من Ab287 لإعادة برمجة الخلايا T، وبالتالي توفير تحسين العلاج بالخلايا T مستضد محددة لT1D7.
ويقال أن الخلايا T السامة للخلايا لتكون قادرة على قتل هدفهم إذا تم التعبير عن حتى نسخة واحدة من ligand كونيت8،9،10. وهكذا، B:9-23/MHCII خلايا CD8 T محددة من المتوقع أن يكون أعلى كفاءة في القضاء على العرض التقديمي مستضد غير المرغوب فيه من الأجسام المضادة الأم، والتي من المرجح أن تحتاج إلى ربط إلى مجمعات متعددة على نفس APC لممارسة تأثيرها. وقد استخدمت خلايا CAR T لعلاج السرطانات البشرية المتعددة11،12،13،ويمكن أيضا أن تكون فعالة في المناعة الذاتية14. ومع ذلك، لم يتم استخدام خلايا CAR-T مع خصوصية لمجمعات الببتيد-MHC المسببة للأمراض حتى الآن لتعديل تطور T1D. باستخدام تقنية نقل الخلايا CD8 T الأمثل الموضحة أدناه، أظهرنا مؤخرًا إثباتًا للمبدأ بأن هذا يمثل في الواقع نهجًا قابلًا للتطبيق7.
وفي هذا البروتوكول، نحدد طريقة فعالة ومبسطة للتنقل والتوسع. بروتوكولنا ينطبق على دراسات أخرى تتطلب توليد الماوس CD8 CAR T الخلايا مع كفاءة عالية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

يتميز مرض السكري من النوع 1 (T1D) بالحصانة الذاتية الخاصة بالأنواع مما يؤدي إلى تدمير خلايا بيتا والفقدان المطلق لإنتاج الأنسولين. في نموذج الماوس غير السمنة التلقائي ة مرض السكري (NOD)، الأنسولين هو الهدف الرئيسي، والتلاعب الوراثي لهذه الحيوانات لإزالة epitope الأنسولين مفتاح واحد يمنع المرض. وهكذا، فإن القضاء الانتقائي على المستضد المهني للخلايا المقدمة (APCs) التي تحمل هذا الظهارة المسببة للأمراض هو نهج لمنع استجابات المناعة الذاتية غير المرغوب فيها الخاصة بالأنسولين، ومن المرجح أن يكون لديه إمكانات أكبر للترجمة.
يمكن لمستقبلات مستضد الشميري (CARs) إعادة توجيه الخلايا T لاستهداف المستضدات المسببة للأمراض بشكل انتقائي. هذه التقنية أساسية للمحاولات الأخيرة لاستخدام الهندسة الخلوية لعلاج الخلايا بالتبني لعلاج السرطانات المتعددة. في هذا البروتوكول، ونحن نصف الأمثل T-خلية الرجعية (RV) transduction وبروتوكول التوسع في المختبر الذي يولد أعدادا كبيرة من الخلايا وظيفية مستضد محدد CD8 CAR-T بدءا من عدد قليل من الخلايا السذاجة. وقد تم وصف بروتوكولات خلايا CAR-T متعددة في السابق، ولكن عادة مع كفاءة تحويل منخفضة نسبيا وصلاحية الخلية بعد التحويل. وعلى النقيض من ذلك، يوفر بروتوكولنا ما يصل إلى 90٪ من كفاءة التحويل، والخلايا التي تم إنشاؤها يمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من أسبوعين في الجسم الحي وتأخير كبير بداية المرض بعد ضخ واحد. نحن نقدم وصفا مفصلا لصيانة الخلايا وبروتوكول التحويل، بحيث يمكن اتباع الخطوات الحرجة بسهولة. يمكن تنفيذ الإجراء بأكمله من عزل الخلية الأساسية إلى تعبير CAR في غضون 14 يومًا. يمكن تطبيق الطريقة العامة على أي نموذج مرض الماوس الذي يعرف الهدف. وبالمثل، فإن التطبيق المحدد (الذي يستهدف مركباً من الفئة الثانية للبببتيد المسبب للأمراض) ينطبق على أي نموذج آخر من نماذج أمراض المناعة الذاتية التي تم تحديد مركب رئيسي لها.

عادةً ما تكون كفاءة التحويل باستخدام هذا البروتوكول ~ 60-90%. في التجربة المبينة في الشكل 3، قبل الفرز تقريبا ، 70 ٪ من خلايا CD8 T شارك في التعبير GFP. كما شاركا في التعبير عن CD28 وCD3 (الشكل3C). الأهم من ذلك، كل من "اختبار" GFP+ الخلايا أيضا ملطخة با?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

توضح هذه المقالة بروتوكولًا لتوليد خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد، وتوسيعها في المختبر، بهدف إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا T الوظيفية لاستخدامها في المختبر وفي الجسم الحي.

توليد عالي الكفاءة من الخلايا T السامة للماوس الأولية الخاصة بالمستضد للاختبار الوظيفي في نموذج مرض السكري المناعي الذاتي

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

هذا البروتوكول يسمح لك لتوليد عدد كبير من الخلايا التائية المستضد وظيفية محددة التي هي النهج المطلوب آمنة في علاج أمراض المناعة الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر لك عملية تحويل عالية الكفاءة وعدد كبير من الخلايا التائية الوظيفية. يمكن توسيع هذه التقنية لعلاج مرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية الأخرى التي تعرف المستضدات.وعلاوة على ذلك، قد تكون خلايا CAR T علاج واعد لأنواع معينة من السرطان. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد خلايا مناعية تعبر عن الـ CARs الأخرى. من المهم أن يكون لديك تقنية مقبولة جيدة ، وقراءة البروتوكول بأكمله وخطة التجربة بأكملها مقدما.هذا البروتوكول لمدة أسبوعين يتضمن خطوات مصغرة والنجاح يعتمد على الأداء السليم لكل خطوة. إن العروض التوضيحية المرئية لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية بالنسبة للمتعلمين لمتابعة بشكل صحيح. إعداد خلايا فينيكس للانعلاق كما هو موضح في المخطوطة.ومن الممارسات الجيدة لوضع علامة على الجدار الجانبي حيث سيتم إضافة المتوسطة وإزالتها لتقليل تهب قبالة الخلايا. في اليوم صفر يتبخر من الخلايا ويغسلها بخمسة ملليلترات من PBS. إضافة بعناية سبعة ملليلتر من انخفاض قطرة متوسطة المصل إلى الجدار الجانبي من لوحة ونقل الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة.إضافة 1.5 ملليلتر من متوسطة المصل انخفاض إلى اثنين من 14 ملليمتر جولة أسفل أنابيب البولي بروبلين. إضافة 40 ميكرومتر من كاشف transfection إلى واحد من الأنابيب و 15 ميكروغرام من الأجسام المضادة إعادة توجيه CAR plasmid جنبا إلى جنب مع خمسة ميكروغرام من بلازميد التعبئة والتغليف إلى الآخر. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ثم إضافة كاشف transfection إلى أنبوب البلازميد.مزيج عن طريق الأنابيب بلطف الحل صعودا وهبوطا ثلاث مرات واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل. إضافة ثلاثة ملليلتر من الخليط إلى خلايا فينيكس ووضعها في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد أربع إلى خمس ساعات إضافة ملليلتر واحد من FCS إلى الخلايا وثقافتها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.في اليوم التالي، إزالة ناظر من الخلايا وإضافة أربعة ملليلتر من ثقافة جديدة قبل الدفء المتوسطة. حصاد الفيروس في اليوم الثاني عن طريق جمع الفيروس الذي يحتوي على المتوسطة من خلايا فينيكس وتصفية لإزالة بقايا حطام الخلية. إضافة المؤتلف البشرية IL-2 المخزون إلى الفيروس لتركيز النهائي من 200 وحدة دولية لكل ملليلتر واستخدامها على الفور في النقل.إضافة أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى خلايا فينيكس ووضعها في الحاضنة بين عشية وضحاها. تكرار جمع الفيروسات في اليوم التالي من أجل عملية نقل ثانية وتجاهل الخلايا. يوم واحد قبل بذر مورين CD8 الخلايا T، إضافة ملليلتر واحد من خليط من المضادة للماوس CD3 وCD28 الأجسام المضادة لكل بئر من 24 لوحة جيدا واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في اليوم صفر، حصاد الطحال الماوس ووضعها على مصفاة الخلية نقع في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في طبق ثقافة الخلية على الجليد. في غطاء لثقافة الخلية، قطع كل طحال إلى ثلاث إلى خمس قطع واستخدام المكبس العقيم من حقنة للضغط على الأنسجة من خلال شبكة الأسلاك. إزالة بلطف خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة تعليق الطحال في واحد إلى أربعة المخفر خلية حمراء مخففة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ثم تمييع 10 ميكرولترات من تعليق الخلية مع Trypan الأزرق لعد الخلايا.وبليه بقية الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 350 مرات ز لمدة سبع دقائق. استخدام ماوس CD8 T خلية عزل عدة لإثراء CD8 الخلايا T وتعليق الكريات الخلية في 400 microliters من المخزن المؤقت مع 100 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة الحيوية لكل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثامنة. اخلطي تعليق الخلية جيداً وحضنيها لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية للسماح بربط الأجسام المضادة.ثم إضافة 300 ميكرولتررس من وضع العلامات العازلة و 200 ميكرولترات من ميكروبينتين المضادة للMicroBeads لكل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثامنة. اخلطي جيداً وينكضن لمدة 10 دقائق أخرى عند أربع درجات مئوية. وفي الوقت نفسه، قم بإعداد عمود فصل على الفاصل وغسله بثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للتسمية.وضع مصفاة 40 ميكرومتر الخلية على الجزء العلوي من عمود وتمرير ملليلتر واحد من خليط الخرزة وخلية من خلال مصفاة في عمود الفصل. جمع تدفق من خلال في أنبوب 15 ملليلتر prechilled وغسل العمود وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة، وجمع النفايات السائلة في نفس الأنبوب. عد الخلايا وجمعها عن طريق الطرد المركزي في 350 مرات ز لمدة خمس دقائق.غسلها مع مليلتر اثنين من خلية تي المتوسطة والطرد المركزي مرة أخرى. ثم resuspend لهم في خلية T قبل الدفء المتوسطة بتركيز من 250، 000 إلى 500، 000 خلية لكل ملليلتر. غسل CD3 أعدت سابقا وCD28 لوحات مضادة المغلفة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم ثلاث مرات وإضافة ملليلترين من تعليق الخلية إلى كل بئر.استخدام حركة دوامة لصرف الخلايا بالتساوي. كتحكم، لوحة نفس العدد من خلايا CD8 T في بئر واحد غير مغلفة من لوحة واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 10٪ ثاني أكسيد الكربون خزان حاضنة لمدة 48 ساعة. في اليوم الأول ، وإعداد شظايا الليفية البشرية لوحات المغلفة عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من الليفية إلى آبار لوحة 24 جيدا واحتضانه على مدى الليل في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، وإزالة حل fibronectin وإضافة ملليلتر واحد من 2٪ BSA وBBS في بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وغسل الآبار المعالجة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم. لوحة جاهزة للاستخدام بعد إزالة محلول الغسيل.عد الخلايا T CD8 تنشيط باستخدام الأزرق Trypan. جمعها عن طريق الطرد المركزي. و إعادة تعليقها بخمسة ملايين خلية قابلة للحياة لكل ملليلتر من أجل النقلإضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلايا CD8 المنشط إلى كل بئر من لوحة مغلفة fibronectin. ثم إضافة 1.5 إلى مليلترين من الفيروس المعد سابقا تحتوي على المتوسطة ومزيج باستخدام حركة دوامة للاستغناء عن الخلايا بالتساوي. ختم لوحة في كيس زيبلوك والطرد المركزي في 2، 000 مرات ز لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية.قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي واصطُلها إلى خزانة السلامة البيولوجية. إزالة بعناية كيس من البلاستيك والتأكد من أن خارج لوحة غير ملوثة مع المتوسطة. نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية من ثاني أكسيد الكربون حاضنة.بعد أربع ساعات، وإزالة ملليلتر واحد من المتوسطة من كل بئر، واستبدالها بميليلتر واحد من خلية تي كاملة مسبقة المدى المتوسطة ووضع لوحة مرة أخرى في الحاضنة. الجوانب الهامة لهذا البروتوكول هي فيروس تتر عالية، الخلايا التائية تنشيط صحية، وطريقة تحويل المناسبة. وكانت الخلايا الملطخة بالاشتراك مع PE حجم سبعة مترافق المضادة لـ CD8، AF647 مترافق المضادة لـ CD3، وBV 421 مترافق المضادة CD28 لتحليل التدفق السيتوميتري.تقريباً، 70٪ من خلايا CD8 T شارك في التعبير عن GFP الذي يشير إلى تعبير CAR. كما أعربوا عن مؤتمري المؤتمر 28 و CD3. الأهم من ذلك, كل من اختبار GFP الخلايا الإيجابية أيضا تشارك في الملطخة مع I-Ag7 الأنسولين BR3 tetramers الذي يشير إلى التعبير عن CAR على سطح الخلية ولكن ليس مع رباعية التحكم.وعلاوة على ذلك، فإن اختبار والسيطرة CAR T الخلايا كل يفرز مستويات عالية من الانفيرون غاما فقط بعد تربية الخلايا المستهدفة مع التعبير عن أربطة المشترك التي تؤكد أن الخلايا العابرة لديها CD8 تأثير T الظاهري الخلية الموجهة نحو الهدف من الأجسام المضادة الأم. إن تحويل خلايا إنتاج الفيروسات، وعزل الخلايا التائية CD8 الأساسية، وتفعيل هذه الخلايا التائية هي أهم خطوات هذه التجربة. وجود خلايا T تنشيط صحية وtransduction من هذه الخلايا التائية مع الكواشف المناسبة يضمن نتائج مواتية.يمكن استخدام هذا الأسلوب إلى transduce الخلايا T الأخرى ولكن يجب تخصيص لنوع خلية T معينة. يمهد هذا البروتوكول الطريق للوقاية من مرض السكري من النوع 1 مع مستضد مستضدات التكيمية الخاصة بالعلاج بالخلايا T.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

إعداد واستخدام HIV - 1 CD4 + T الابتدائية المصابة خلايا والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية فحوصات السامة للخلايا

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

التالية في الوقت الحقيقي تأثير العوامل الالتهاب الرئوي الحاد الفوعة في نموذج الفأر الالتهاب الرئوي عن طريق البكتيريا للإضاءة الحيوية

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...