Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, og SRA-2-S-2018-648-S-B, en diabetes Education and action Award, og Caroline Wiess Law Fund for forskning i Molekylær medicin på Baylor College of Medicine. Celle sortering blev understøttet af cytometri og Cell sortering Core på Baylor College of Medicine med støtte fra NIH (S10RR024574 og P30CA125123). Alle peptid-MHC-tetramerne blev hentet fra NIH Tetramers kerneanlæg.

Mus blev opretholdt under specifikke patogenfri forhold på en transgene muse facilitet, og alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Baylor College of Medicine Animal Care og brug udvalg.
Bemærk: eksperimentet kræver, at virussen og T-cellerne forberedes parallelt. Tabel 1 opsummerer protokollen. De vigtigste reagenser og buffere er opført i tabellen over materialer. Vi fokuserer på generering og udvidelse af bil-T-celle...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Denne protokol beskriver en effektiv metode til fremstilling af antigen specifikke CD8-T-celler ved antiretroviral transduktion. Transduktiviteten af vores protokol er typisk høj, og robust ekspression af bilen er generelt observeret. De udvidede bil-T-celler bevarer de vigtigste egenskaber ved de forældre aktiverede T-celler og antistof specificitet og er velegnede til både in vitro og in vivo brug. Vi har anvendt AB-bil CD8 T celler i reprograming type 1 diabetes i NOD mus7.
<p class="jov...

I betragtning af den sandsynlige reducerede risiko for uønskede off-Target effekter, antigen-specifikke immunterapi (ASI) er lovende behandlinger for autoimmune sygdomme som T1D. Akkumulerende evidens tyder på, at immunresponset på (prepro) insulin kan være særlig vigtigt i T1D1. I det seneste årti, undersøgelser fra flere grupper, herunder vores egen, kraftigt tyder på, at præsentationen af en epitop indeholdende insulin B kæde aminosyrer 9 til 23 ved specifikke MHC klasse II molekyler (B: 9-23/mhcii), spiller en vigtig rolle i udviklingen af T1D i mus og mennesker2,3,4,5. For selektivt at målrette B: 9-23/MHCII-komplekset genererede vi et monoklonalt antistof, der hedder mAb287, der ikke har nogen krydsreaktivitet til hormonet insulin eller komplekser, der indeholder andre peptider6. MAb287 blokke antigen præsentation in vitro, og ugentlig administration af mAb287 til præ-diabetisk NOD mus forsinket udviklingen af T1D i 35% af de behandlede mus6. For at blokere antigen præsentationen in vivo er hyppige injektioner typisk påkrævet for at opretholde en høj cirkulerende koncentration. Vi hypotese, at vi kunne overvinde dette problem ved at drage fordel af den høje specificitet af Ab287 at omprogrammere T-celler, hvilket giver en forbedret antigen-specifik T celleterapi for T1D7.
Cytotoksiske T-celler er rapporteret at være i stand til at dræbe deres mål, hvis selv en enkelt kopi af deres cognate ligand udtrykkes8,9,10. Således, B: 9-23/MHCII specifikke CD8 T celler forventes at have højere effektivitet i at eliminere uønsket antigen præsentation end det overordnede antistof, som sandsynligvis vil være nødvendigt at binde sig til flere komplekser på samme APC til at udøve sin virkning. Bil T celler har været anvendt til behandling af flere menneskelige kræftformer11,12,13, og kan også være effektiv i autoimmunitet14. Men, bil-T-celler med specificitet for patogene peptid-MHC komplekser er ikke hidtil blevet brugt til at ændre progression af T1D. Ved at bruge den optimerede CD8 T Cell transduktionsteknik, der er beskrevet nedenfor, demonstrerede vi for nylig princippet om, at dette faktisk repræsenterer en holdbar tilgang7.
I denne protokol skitserer vi en effektiv og strømlinet transduktions-og udvidelsesmetode. Vores protokol gælder for andre undersøgelser, der kræver generering af mus CD8 bil T-celler med høj effektivitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

Type 1 diabetes (T1D) er karakteriseret ved ø-specifik autoimmunitet fører til beta celle ødelæggelse og absolut tab af insulinproduktion. I den spontane ikke-fede diabetes (NOD) musemodel, insulin er det primære mål, og genetisk manipulation af disse dyr til at fjerne en enkelt nøgle insulin epitop forebygger sygdom. Således selektiv eliminering af professionelle antigen præsentere celler (APCS) bærer denne patogene epitop er en tilgang til at hæmme de uønskede insulin-specifikke autoimmune reaktioner, og sandsynligvis har større translationel potentiale.
Chimeriske antigen receptorer (biler) kan omdirigere T-celler til selektivt at målrette sygdomsfremkaldende antigener. Denne teknik er grundlæggende for nylige forsøg på at bruge cellulære teknik til adoptiv celleterapi til behandling af flere kræftformer. I denne protokol beskriver vi en optimeret T-Cell retrovirus (RV) transduktion og in vitro-udvidelsesprotokol, der genererer et stort antal funktionelle antigen-specifikke CD8 Car-T-celler startende fra et lavt antal naive celler. Tidligere er flere bil-T-celle protokoller blevet beskrevet, men typisk med relativt lav transduktionseffektivitet og cellelevedygtighed efter transduktion. I modsætning hertil giver vores protokol op til 90% transduktionseffektivitet, og de genererede celler kan overleve mere end to uger in vivo og signifikant forsinke sygdommens indtræden efter en enkelt infusion. Vi giver en detaljeret beskrivelse af cellen vedligeholdelse og transduktionsprotokol, således at de kritiske trin let kan følges. Hele proceduren fra primær celle isolation til bil udtryk kan udføres inden for 14 dage. Den generelle metode kan anvendes på enhver muse sygdomsmodel, hvor målet er kendt. Tilsvarende gælder den specifikke applikation (som er rettet mod et patogen peptid/MHC klasse II-kompleks) for enhver anden autoimmun sygdomsmodel, for hvilken der er identificeret et nøgle kompleks.

Typisk er transduktiviteten ved hjælp af denne protokol ~ 60-90%. I forsøget vist i figur 3, før sortering ca., 70% af de CD8 T-celler Co-udtrykte gfp. De medgav også CD28 og CD3 (figur 3c). Det er vigtigt, at alle de "test" gfp+ -celler også er co-farvede med IAG7-b:R3 tetramers, men ikke med kontrol transthyretin (figur 4). Tilsvarende, de sorteret test og kontrol bil-T c...

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

I denne artikel beskrives en protokol for generering af antigen specifikke CD8 T-celler og deres ekspansion in vitro med det formål at fremsætte et stort antal funktionelle T-celler til brug in vitro og in vivo.

Højeffektiv generation af antigen-specifikke primære mus cytotoksiske T-celler til funktionel testning i en autoimmun diabetes model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Denne protokol giver dig mulighed for at generere et stort antal funktionelle antigen-specifikke T-celler, som er en ønsket sikker tilgang til behandling af autoimmune sygdomme. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver dig en højeffektiv transduktionsproces og et stort antal funktionelle T-celler. Denne teknik kan udvides til behandling af type 1 diabetes og andre autoimmune sygdomme, hvor antigener er kendt.Desuden kan CAR T-celler være en lovende behandling for visse typer af kræft. Denne metode kan bruges til at generere immunceller, der udtrykker andre CARs. Det er vigtigt at have god accepteret teknik, læse hele protokollen og planlægge hele eksperimentet på forhånd.Denne to uger lange protokol indeholder mini-trin og succes er afhængig af korrekt ydeevne af hvert trin. Visuelle demonstrationer af denne metode er afgørende for eleverne at følge korrekt. Forbered Phoenix celler til transfektion som beskrevet i manuskriptet.Det er god praksis at markere sidevæggen, hvor medium vil blive tilføjet og fjernet for at minimere blæser ud celler. På dag nul aspirere supernatanten fra cellerne og vask dem med fem milliliter PBS. Tilsæt forsigtigt syv milliliter reduceret serummedium til pladens sidevæg og overfør cellerne tilbage til inkubatoren.Der tilsættes 1,5 milliliter reduceret serummedium til to 14 millimeter runde polypropylenrør. Der tilsættes 40 mikrometer transfektionsreage til et af rørene, og 15 mikrogram antistof omdirigeret CAR plasmid sammen med fem mikrogram emballage plasmid til den anden. Slangerne inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter, og der tilsættes derefter transfektionsreage til plasmidrøret.Bland ved forsigtigt at pipettere opløsningen op og ned tre gange og inkubere den ved stuetemperatur i mindst 20 minutter. Tilføj tre milliliter af blandingen til Phoenix celler og placere dem i en væv kultur kuvøse. Efter fire til fem timer tilføje en milliliter FCS til cellerne og kultur dem natten over på 37 grader Celsius.På den næste dag skal du fjerne supernatanten fra cellerne og tilføje fire milliliter frisk forvarmet kulturmedium. Høst virus på dag to ved at indsamle virus, der indeholder medium fra Phoenix celler og filtrere det til at fjerne resterende cellerester. Der tilsættes rekombinant human IL-2-bestand til virussen for en endelig koncentration på 200 internationale enheder pr. milliliter, og brug den straks til transduktion.Tilføj fire milliliter frisk medium til Phoenix celler og læg dem i rugemaskine natten over. Gentag virus indsamling på den næste dag for en anden transduktion og kassér cellerne. En dag før såning murine CD8 T-celler, tilsæt en milliliter af en blanding af anti-mus CD3 og CD28 antistoffer til hver brønd af en 24 brønd plade og inkubere pladen natten over ved fire grader Celsius.På dag nul, høst musen milter og læg dem på en celle si iblødsætning i 10 milliliter PBS i en celle kultur parabol på is. I en cellekulturhætte skæres hver milt i tre til fem stykker, og brug et sterilt stempel af en sprøjte til at presse vævet gennem trådnet. Fjern forsigtigt røde blodlegemer ved at resuspendere miltytter i en til fire fortyndede røde celle lysis buffer og inkubere dem ved stuetemperatur i fem minutter derefter fortynde 10 mikroslitere af cellen suspension med Trypan Blue for celletælling.Og pellet resten af cellerne ved centrifugering på 350 gange g i syv minutter. Brug en mus CD8 T celle isolation kit til at berige CD8 T-celler og suspendere celle pellets i 400 mikroliter buffer med 100 mikroliter af biotin antistof cocktail pr en gange 10 til den ottende celler. Bland celle suspension godt og inkubere det i fem minutter ved fire grader Celsius at give mulighed for antistof binding.Derefter tilsættes 300 mikroliter mærkningsbuffer og 200 mikroliter anti-biotinmikroper pr. gange 10 til de ottende celler. Bland godt og inkubere i yderligere 10 minutter ved fire grader Celsius. I mellemtiden skal du oprette en skillekolonne på separatoren og vaske den med tre milliliter mærkningsbuffer.Sæt en 40 mikrometercellestud på toppen af en kolonne og før en milliliter af perle- og celleblandingen gennem sien ind i skillesøjlen. Strømmen opsamler til et forskudt 15 milliliterrør, og kolonnen vaskes i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger og opsaml spildevandet i samme rør. Tæl cellerne og opsaml dem ved centrifugering ved 350 gange g i fem minutter.Vask dem med to milliliter T-cellemedium og centrifuge igen. Derefter resuspendere dem i prewarmed T celle medium i en koncentration på 250, 000 til 500, 000 celler pr milliliter. De tidligere påbelavede CD3- og CD28-antistofbelagte plader vaskes med en milliliter steril PBS tre gange, og der tilsættes to milliliter cellesuspension til hver brønd.Brug en hvirvlende bevægelse til at dispensere celler jævnt. Som en kontrol, plade det samme antal CD8 T-celler i en enkelt ikke-belagt brønd af pladen og inkubere cellerne ved 37 grader Celsius i en 10% kuldioxid gastank inkubator i 48 timer. På dag ét, forberede menneskelige fibronectin fragment belagt plader ved at tilføje 0,5 milliliter fibronectin til brøndene af en 24-brønd plade og inkubere det i løbet af natten ved fire grader Celsius.Den næste dag fjernes fibronectinopløsningen, og der tilsættes en milliliter 2% BSA og PBS pr. brønd. Pladen inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter, og de behandlede brønde vaskes med en milliliter steril PBS. Pladen er klar til brug efter fjernelse af vaskeopløsning.Tæl de aktiverede CD8 T-celler ved hjælp af Trypan Blue. Indsamle dem ved centrifugering. Og resuspend dem på fem millioner levedygtige celler pr milliliter til transduktion.Der tilsættes 100 mikroliter af den aktiverede CD8-cellesuspension til hver brønd af den fibronectinbelagte plade. Derefter tilsættes 1,5 til to milliliter af den tidligere forberedte virus, der indeholder medium og blandes ved hjælp af en hvirvlende bevægelse til jævnt dispenseret cellerne. Forsegle pladen i en Ziploc taske og centrifuge det på 2, 000 gange g i 90 minutter ved 37 grader Celsius.Fjern pladen fra centrifugen og tag den med til et biologisk sikkerhedsskab. Fjern forsigtigt plastposen og sørg for, at ydersiden af pladen ikke er forurenet med medium. Overfør pladen til en 37 grader Celsius kuldioxid inkubator.Efter fire timer fjernes en milliliter medium fra hver brønd, den udskiftes med en milliliter forvarmet komplet T-cellemedium og sætte pladen tilbage i inkubatoren. De kritiske aspekter af denne protokol er en høj titer virus, sunde aktiverede T-celler, og den relevante transduktionsmetode. Cellerne blev co-plettet med PE størrelse syv konjugerede anti-CD8, AF647 konjugerede anti-CD3, og BV 421 konjugeret anti-CD28 for flow cytometrisk analyse.Ca. 70 % af CD8 T-cellerne udtrykte IRP, hvilket indikerer CAR-udtryk. De har også co-udtrykt CD28 og CD3. Det er vigtigt, at alle de GFP-positive testceller også farves sammen med I-Ag7 insulin BR3 tetramers, som indikerer ekspression af CAR på celleoverfladen, men ikke med kontrolte tetrameren.Endvidere udskilles de sorterede test- og kontrol-CAR T-celler hver især høje interferongammaniveauer efter cokultur med målceller, der udtrykker deres cognate-ligaander, hvilket bekræfter, at de transanucerede celler har en CD8-effektor T-cellefænotype rettet mod målet for moderantistofferne. Transduktion af virusproducerceller, isolering af primære CD8 T-celler og aktivering af disse T-celler er de vigtigste trin i dette eksperiment. At have sunde aktiverede T-celler og transduktion af disse T-celler med passende reagenser sikrer gunstige resultater.Denne metode kan bruges til at transduce andre T-celler, men det skal tilpasses til den specifikke T-celletype. Denne protokol baner vejen for forebyggelse af type 1 diabetes med antigen-specifikke kimære antigen receptor T-celle terapi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering af inducerede regulatoriske T-celler fra primære humane naive og memory T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Efter i Real Time konsekvenserne af Pneumokok virulensfaktorer i en akut Mouse Lungebetændelse Model Brug Bioluminescent Bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigen-præsenterende celler (KaAPC) til effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Udtømning af humane antigen-specifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering af leukocytter fra musehud anvendelse af enzymatiske Digest og Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Udvikling af Stem Cell-afledte antigen-specifikke regulatoriske T celler mod Autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion og berigelse af Rare Antigen-specifikke B-Celler til analyse af fænotype og funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay til påvisning af Antigen-specifikke T-celle cytolytisk funktion ved hjælp af en Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...